選擇細(xì)胞裂解物對活細(xì)胞中重組蛋白表達是很有用的，它們可以裂解真核細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞，并去除蛋白質(zhì)中所有不需要表達的成分。這些裂解物可以與DNA模板和其他所需成分在試管中結(jié)合，進行蛋白質(zhì)的表達（1）。

Figure 1: Cell-free expression components and additives

Figure 2: Production of a target protein with living cells

優(yōu)勢

1. 無細(xì)胞反應(yīng)很容易建立，僅需幾個小時就可以完成蛋白質(zhì)表達。這種方法可以用小規(guī)模（50-100微升）的反應(yīng)快速完成反應(yīng)條件的優(yōu)化，優(yōu)秀的條件能被線性放大到其所需的數(shù)量。

2. 總處理量小：對于可溶性蛋白，幾毫升的反應(yīng)就可以得到毫克量的蛋白。

3. 作為一個開放的系統(tǒng)，許多成分（天然的和非天然的），均可以被添加到反應(yīng)混合物中，如還原/氧化元素、分子伴侶、標(biāo)記的氨基酸或去污劑。如此，蛋白質(zhì)可以直接用于核磁共振，也可將膜蛋白在新生狀態(tài)下重組到納米盤系統(tǒng)中，而無需任何人造去污劑（10-12）。

4. 真核細(xì)胞的裂解物能進行翻譯后修飾，如糖基化或磷酸化，并可將天然的細(xì)胞膜成分（如微粒體）插入膜蛋白（9）。

5. 通常可以在無細(xì)胞系統(tǒng)中進行活細(xì)胞毒性蛋白的表達，由于已經(jīng)去除了負(fù)責(zé)（功能）的細(xì)胞成分，所以不會受到如蛋白消化酶或DNA模板不穩(wěn)定的影響。

6. 多聚體蛋白和復(fù)合物都能被表達，且DNA模板滴定會影響不同亞基的比例。

劣勢

1. 如果蛋白質(zhì)需求量大或者蛋白質(zhì)表達低，無細(xì)胞表達會相當(dāng)昂貴。因此，對于每一種蛋白質(zhì)，應(yīng)在小規(guī)模實驗中評估可達到的產(chǎn)量，并計算放大的成本，這對來自真核生物更復(fù)雜的無細(xì)胞裂解物來說更應(yīng)如此。

表1 不同無細(xì)胞表達系統(tǒng)的比較

·表達篩選：通過無細(xì)胞表達，您可以在兩天內(nèi)從DNA模板-甚至是多個平行應(yīng)得到免疫印跡的結(jié)果，這使得該系統(tǒng)對于快速篩選多個構(gòu)建體和反應(yīng)條件更具吸引力。

·蛋白標(biāo)記：開放式系統(tǒng)可以與標(biāo)記的氨基酸相結(jié)合，例如生物素或熒光標(biāo)簽。

·核磁共振：可以很容易地將同位素標(biāo)記的氨基酸添加到混合物中，獲得準(zhǔn)備用于核磁共振的蛋白質(zhì)。

   ·結(jié)晶：與硒代蛋氨酸結(jié)合，在一個簡單的步驟中獲得蛋白質(zhì)重金屬衍生物。

Figure 2: Production of a target protein with living cells

膜蛋白特殊的適應(yīng)性

由于蛋白質(zhì)是在一個開放的系統(tǒng)中表達的，與活細(xì)胞表達相比，無細(xì)胞表達促進了許多應(yīng)用，包括：

·不溶性表達：在不添加任何種類的脂質(zhì)或去污劑的情況下，形成膜蛋白聚集體，在諸多情況下可以重新折疊成功能蛋白。

·去污劑：尤其是Brij系列的去污劑，多數(shù)情況下將其加入以溶解膜蛋白。如果需要，可以在后續(xù)步驟中交換去污劑，但需要是在純化過程中。(2-7)

·納米磷脂盤：在無細(xì)胞反應(yīng)中加入納米磷脂盤，是獲得穩(wěn)定性蛋白質(zhì)簡單和簡便的方法，不需要去污劑，可用于各種檢測（10-15）。其應(yīng)用范圍包括生物物理學(xué)分析、表面等離子共振、核磁共振和冷凍電鏡的質(zhì)譜分析。最近有研究表明，通過納米磷脂盤，膜蛋白在無細(xì)胞裂解物中的表達可通過中觀方法進行結(jié)晶（14），了解更多關(guān)于納米磷脂盤的信息。

·脂質(zhì)體和其他脂質(zhì)顆粒：如脂質(zhì)體、微粒體和其他含脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)（如雙層膜微胞），已被添加到無細(xì)胞反應(yīng)中，尤其是與昆蟲細(xì)胞裂解物結(jié)合進行膜蛋白的表達（9）。使用適量的去污劑，還可以將膜蛋白從納米磷脂盤轉(zhuǎn)移到雙層膜微胞中（13）。

間歇式和無細(xì)胞持續(xù)交換方法

通常可按兩種方法進行無細(xì)胞反應(yīng)：

1. 間歇式：可以輕松的在簡易管中進行間歇式無細(xì)胞反應(yīng)，如離心管。其反應(yīng)時間很短（1-3小時），因為能量物質(zhì)很快就被消耗完了，而最終產(chǎn)物的積累會減緩酶促反應(yīng)的速度，因此蛋白質(zhì)的產(chǎn)量通常會很低。

2.無細(xì)胞持續(xù)交換或半透膜：無細(xì)胞持續(xù)交換（CECF）反應(yīng)是通過半透膜進行的，所以可向反應(yīng)提供能量物質(zhì)，并去除最終產(chǎn)物，如ADP。如此，反應(yīng)時間就可以達到24小時，對于表達量高的可溶性蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)每毫升的產(chǎn)量可以達到幾毫克（8）。

References:

1. Endo, Y. et al. (eds) Cell-Free Protein Production, Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology vol. 607 (2010)

2. Nirenberg, M. W., Matthaei, J. H. "The Dependence of Cell- Free Protein Synthesis in E. Coli Upon Naturally Occurring or Synthetic Polyribonucleotides". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 47 (10): 1588–1602 (1961)

3. Roos, C. et al. Characterization of co-translationally formed nanodisc complexes with small multidrug transporters, proteorhodopsin and with the E.coli MraY translocase. Biochim. Biophys. Acta 1818; 3098-3106 (2012)

4. Proverbio, D. et al. Functional properties of cell-free expressed human endothelin A and endothelin B receptors in artificial membrane environments. Biochim. Biophys. Acta 1828, 2182-92 (2013)

5. Roos, C. et al. High-level cell-free production of membrane proteins with nanodiscs. In: Cell-free Protein Synthesis: Methods and Protocols. Alexandrov, K., and Johnston, W.A. (eds), Methods in Molecular Biology vol. 1118, Chapter 7 (2014)

6. Sachse, R. et al. Membrane protein synthesis in cell-free systems: From bio-mimetic systems to bio-membranes. FEBS Lett. 588,2774-2781 (2014)

7. Jackson, A.M. "Cell-free protein synthesis for proteomics". Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 2 (4): 308–319 (2004)

8. Court, R., Cook, N., Saikrishnan, K., Wigley, D. The Crystal Structure of λ-Gam Protein Suggests a Model for RecBCD Inhibition, Journal of Molecular Biology, Volume 371, Issue 1 (2007)

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12. Proverbio, D. et al. Membrane protein quality control in cell-free expression sysems: Tools, strategies and case studies. Membrane proteins production for structural analysis (Isabelle Mus-Veteau, ed.) Springer Heidelberg. ISBN:978-1-4939-0662-8.

13. Haberstock, S. et al. A systematic approach to increase the efficiency of membrane protein production in cell-free expression systems. Prot. Exp. Purific. 82, 308-16 (2012)

14. Matthies, D. et al. Cell-free expression and assembly of a macromolecular membrane protein complex. J. Mol. Biol. 413, 593-603 (2011)

15. Schneider, B. et al. Membrane protein expression in cell-free systems. Metho. Mol. Biol. 601, 165-86 (2010)

16. Laguerre, A. et al. From nanodiscs to isotropic bicelles: A procedure for solution nuclear magnetic resonance studies of detergent-sensitive integral membrane proteins. Structure 24, 1-12 (2016)

17. Nikolaev, M. et al. Integral membrane proteins can be crystallized directly from nanodiscs. Cryst. Growth Des. 17(3), 945–948 (2017)

18. Henrich, E. et al. Analyzing native membrane protein assembly in nanodiscs by combined non-covalent mass spectrometry and synthetic biology. eLife 6:e20954 (2017)

19. Schwarz, D. et al. Preparative scale expression of membrane proteins in E.coli based continuous exchange cell-free systems. Nat. Protocols 2, 2945-57 (2007)