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納升液相系統因具有非常高的靈敏度，常用于蛋白質組學工作流程中，特別是當可用樣品量非常低的時候。高質量的色譜分離對于蛋白質鑒定很重要，因為良好的峰形和分離可以減少離子抑制，并允許質譜系統采樣盡可能多的特異性肽段。
在本研究中，我們結合使用納升液相系統與Zeno SWATH DIA流程，以評估ZenoTOF™ 7600系統使用納升系統時蛋白鑒定和定量的能力。
?液相方法：液相系統：NanoLC 425系統(SCIEX)，色譜柱：核殼Biozen 5 μm Peptide XB-C18 (0.075 x 500 mm, 5 μm, P/N 00j -4792- w - sx)，流速：400 nL/min，梯度：60min。
?質譜方法：質譜：ZenoTOF™ 7600系統，離子源：OptiFlow Turbo V離子源，采集模式：Zeno SWATH DIA，可變窗口數：100個，累積時間：25毫秒，二級MS/MS模式下啟用Zeno Trap（Zeno阱），樣品采集三份平行數據。
?數據分析：Zeno SWATH DIA數據使用DIA- NN軟件處理，分別使用自建庫和非自建庫流程，數據庫為之前由OneOmics生成的人細胞裂解液數據庫。
主要結果：
1.不同進樣量時蛋白質鑒定和定量測試
我們使用K562細胞裂解液樣品，在1小時的液相梯度中，使用Zeno SWATH DIA采集質譜數據，在DIA-NN中采用自建庫分析，發現隨著上樣量的增加，蛋白質的鑒定數也增加了（圖1）。在三次重復實驗中，確定FDR <1%，CV <20%的定量蛋白質數量。當柱上進樣200 ng樣品時，鑒定蛋白質約6800個，可定量蛋白質約6300個(92%)。
圖1. 不同進樣量時蛋白質鑒定和定量數量
對比不同進樣量時定量到的FDR <1%，CV <20%肽段，可以看到隨著進樣量增加，60min納升流速梯度中鑒定（空心標志）和定量（實心標志）的肽段數量也在增加（圖2）。在100 ng進樣量時，約67,000個肽段被鑒定到，其中約80%被定量到。
圖2. 不同進樣量時肽段鑒定和定量數量
2.數據分析時使用自建數據庫和非自建庫對比
我們使用DIA-NN軟件對比了相同Zeno SWATH DIA數據在使用自建數據庫和不使用自建庫時，蛋白質鑒定和定量數量的區別。自建數據庫方法中使用的數據庫為之前通過DDA鑒定建立的人細胞裂解液數據庫；非自建庫方法中使用的為從人FASTA文件中生成的理論數據庫。在蛋白質和肽段的鑒定和定量中，兩個方法所得到的結果非常相似。此外，使用另外一個理論公共數據庫Pan human數據庫時，Zeno SWATH DIA數據也能得到類似的結果（圖3左上及右上）。
為了進一步測試非自建庫方法的保真度，對使用理論數據庫與DDA自建庫中分別鑒定到的蛋白質進行對比。維恩圖(圖3，下)顯示，這些方法可以得到非常接近的結果，這進一步表明使用理論數據庫也可以得到很好的蛋白質鑒定和定量分析結果，將給Zeno SWATH DIA數據分析帶來很大的便利。
圖3. 對比三種不同數據庫處理數據時的蛋白鑒定結果
圖3說明：3個不同的數據庫（Lib Free，使用在FASTA文件的理論庫；PHL，Pan human公共數據庫；ZT Lib，根據Zeno DDA建立的數據庫）。上圖為FDR <1%（柱狀圖透明部分）和CV <20%（柱狀圖實心部分）時蛋白質鑒定和定量數量，下圖為使用非自建數據庫方法或自建庫方法中鑒定蛋白質的數量對比，二者重合度很高。
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