DNA/RNA提取試劑盒說明書

AllPureDNA/RNAKit

DNA/RNA提取試劑盒說明書

Cat.No.  K0590 

  保存：室溫

組分說明

                                              Cat.No.               K0590



                                              KitSize                  50

                                            BufferRL                35ml

                                            BufferRW1                40ml

                                   BufferRW2（concentrate）           11ml

                                         RNase-FreeWater             10ml



                                    BufferGW1（concentrate）           13ml

                                   BufferGW2（concentrate）           15ml

                                             BufferGE                15ml



                                         SpinColumnDM                 50

                                        SpinColumnRM                 50

                                     CollectionTube（1.5ml）           100

                                     CollectionTube（2ml）            150

產品簡介

      本試劑盒可用于從同一細胞或組織樣本中同時純化基因組 DNA 和總 RNA。由于不需要將樣本分成兩份用于不同的純化步驟，該試劑盒可最大限度的回收 DNA 和 RNA。純化的 DNA 和 RNA 被單獨洗脫并可直接用于各種下游實驗。本試劑盒中不包含苯酚和氯仿等有毒物質，無需乙醇沉淀，操作簡單、快捷。基因組 DNA 可用于 PCR、Real-timePCR、SouthernBlot、DotBlot、比較基因組雜交（CGH）、基因分析和 SNP 分析；總 RNA 可用于 RT-PCR、Real-timeRT-PCR、cDNA 的合成、NorthernBlot、DotBlot 等分析。

注意事項

1.   預防RNase污染，應注意以下幾方面：

1) 使用無RNase的塑料制品和槍頭，避免交叉污染。

2) 玻璃器皿應在使用前于180℃高溫下干烤4小時，塑料器皿可在0.5MNaOH中浸泡10分鐘，用水*沖洗后高壓滅菌。

3) 配制溶液應使用RNase-FreeWater。

4) 操作人員戴一次性口罩和手套，實驗過程中要勤換手套。

2.   樣品應避免反復凍融，否則影響提取DNA和RNA的質量。樣品在BufferRL中，可于-70℃保存一個月。

3.   BufferRL在使用前請加入β-巰基乙醇，1mlBufferRL加10 μl β-巰基乙醇。加入β-巰基乙醇的BufferRL室溫可保存1個月。

4.   第一次使用前應按照試劑瓶標簽的說明在 BufferRW2、BufferGW1 和 BufferGW2 中加入無水乙醇。

5.   使用前請檢查 BufferRL 是否出現結晶或者沉淀，如有結晶或者沉淀，請于 56℃水浴重新溶解。

6.   所有離心步驟均使用臺式離心機，室溫下進行。

自備試劑：β-巰基乙醇（新開封或提取 RNA 專用）、70%乙醇（用無 RNase 的水配制）、無水乙醇

操作步驟

1.   材料處理

    1a. 貼壁培養的細胞應先處理為細胞懸液（最大提取量為10⁷ 個細胞）, 收集細胞，棄盡培養液，加入600μlBufferRL（用前檢查是否加入β-巰基乙醇），反復吹打使其充分裂解。

 注意：一定要棄盡培養液，否則影響裂解和后續的核酸純化步驟。

    1b. 取不大于30mg的動物組織，液氮研磨成細粉末，加入600μlBufferRL（用前檢查是否加入β-巰基乙醇），或直接加入600μlBufferRL（用前檢查是否加入β-巰基乙醇），勻漿處理。

         注意：勻漿要充分，否則影響RNA產量。

2.   將上步所得溶液12,000rpm（～13,400×g）離心3-5分鐘，小心的將上清加入到已裝入收集管（2mlCollectionTube）的吸附柱（SpinColumnDM）中，12,000rpm離心30-60 秒，收集濾液。將吸附柱DM放在一個新的2ml收集管

     （2mlCollectionTube）中，室溫或4℃放置，待提DNA。

     注意：確保吸附柱 DM上沒有液體殘留，如果有必要可以重復離心，直至所有的液體通過吸附柱DM的膜。總RNA提取

3.   向步驟2所得濾液中加入1倍體積的70%乙醇（無RNase的水配制），混勻。

4.   將上步所得溶液全部加入到已裝入收集管（2mlCollectionTube）的吸附柱（SpinColumnRM）中，若一次不能全部加完溶液，可分次轉入。12,000rpm離心20秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱RM重新放回2ml收集管中。

5.   向吸附柱RM中加入700 μlBufferRW1,12,000rpm離心20秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱RM重新放回2ml收集管中。

6.向吸附柱RM中加入500 μlBufferRW2（使用前檢查是否已加入無水乙醇）,12,000rpm離心20秒, 倒掉收集管中的廢液，將吸附柱RM重新放回2ml收集管中。

7.   重復步驟6。

8.   12,000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱RM置于室溫數分鐘，以*晾干。

     注意：此步驟目的是去除吸附柱RM中殘余的乙醇，乙醇的殘留會影響后續的酶促反應（酶切、PCR等）。

9.   將吸附柱RM置于一個新的無RNase1.5ml離心管（CollectionTube1.5ml）中，向吸附柱RM的中間部位加入30-50μlRNase-FreeWater，室溫放置2-5分鐘，12,000rpm離心1分鐘，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。

注意：1）RNase-FreeWate體積不應小于30 μl，體積過小影響回收率。

    2）如果要提高RNA的產量，可用30-50 μl新的RNase-FreeWater重復步驟9。         

3）如果要提高RNA濃度，可將得到的溶液重新加入到吸附柱中，重復步驟9。

基因組DNA 提取

10.  向吸附柱 DM 中加入 500 μlBufferGW1（使用前檢查是否加入無水乙醇）,12,000rpm  離心 20 秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱 DM 放回 2ml 收集管中。

11.  向吸附柱DM中加入500 μlBufferGW2（使用前檢查是否已加入無水乙醇）,12,000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱DM放回2ml 收集管中。

12.  12,000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱DM置于室溫數分鐘，以*晾干。

     注意：這一步的目的是將吸附柱DM中殘余的乙醇去除，乙醇的殘留會影響后續的酶促反應（酶切、PCR等）。

13.  將吸附柱DM置于一個新的無RNase1.5ml離心管（CollectionTube1.5ml）中，向吸附柱DM的中間部位加入100 μlBufferGE，室溫放置2-5分鐘，12,000rpm離心2分鐘，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。

注意：1）BufferGE的體積不應小于100 μl，體積過小影響回收率。

   2）如果要提高DNA的產量，將100 μl新的BufferGE加至吸附柱上，重復步驟13。

3）如果要提高DNA濃度，可以將步驟15所得的DNA洗脫液重新加至吸附柱上，重復步驟13。

附表 1 吸附柱 DM 和吸附柱 RM 的規格說明

規格                   吸附柱 DM                 吸附柱 RM

最大結合能力          100µgDNA            100µgRNA

最大加樣量               700µl               700µl

結合核酸分子量         DNA15–30kb         RNA>200 核苷酸

最小洗脫體積              100µl                30µl

  

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