Rho1D4是指牛視紫紅質的細胞內C末端的最后9個氨基酸，它是由與該序列特異性結合的單克隆抗體而命名的。通過與Rho1D4抗體結合，此序列可作為一種高特異性的純化標簽用于膜蛋白的純化。采用分子生物學方法將目的膜蛋白的C末端加上Rho1D4標簽（圖1），具有該序列的目的蛋白可被載有rho1D4抗體的親和基質特異性結合，隨后目的蛋白可通過添加過量的Rho1D4肽與基質抗體競爭性結合被洗脫下來，這種洗脫條件比改變pH更加溫和。

圖1：具有3個跨膜結構域的假設膜蛋白，將序列為TETSQVAPA的Rho-1D4標簽添加至其C末端。

 
Rho1D4系統介紹
20世紀80年代對Rho1D4表位和抗體進行了表征，并通過將抗體與Sepharose®珠子偶聯來純化猴腎細胞中表達的牛視紫紅質。此后，Rho1D4系統（標簽，抗體偶聯親和基質，洗脫肽）被用于個別膜蛋白的研究，包括G蛋白偶聯受體（GPCR），ATP結合轉運蛋白，溶質反轉運蛋白和四跨膜蛋白。該系統的一個優點是抗體-表位相互作用的高度特異性，而表位的序列和鏈長對于和抗體的結合是至關重要的。例如，用去除單個甲基的甘氨酸替代第三個丙氨酸可破壞二者的結合。同樣，完整的9個氨基酸標簽與Rho1D4抗體的結合緊密，去除2個氨基酸可破壞二者結合。因此，那些含有與Rho1D4表位相似序列的蛋白質的與抗體的非特異性結合可被降低，純化到的蛋白都有較高的純度（表格1）。

第1步：結合。將帶Rho1D4標簽的蛋白質與載有Rho1D4抗體的瓊脂糖孵育，從裂解物中純化目的蛋白。

第2步：洗滌。洗去雜蛋白和其他裂解物組分，只保留目的蛋白結合在親和基質上。

第3步：洗脫。過量的Rho1D4肽競爭性地結合基質，靶蛋白被洗脫在洗脫液里。
 
Rho1D4系統的優點

Rho1D4系統的另一個優點是較高的目的蛋白回收率。包括細菌，酵母和哺乳動物細胞表達系統，已選擇性的對一些GPCR和其他膜蛋白進行了優化。用Rho1D4系統純化膜蛋白后可通過凝膠過濾層析或離心濃縮來除去洗脫肽。在所有表達系統中，蛋白質的產量都能達到毫克級別（表1）。純化的蛋白質可用于功能研究，如配體結合的鑒定以及蛋白質間的相互作用。例如，將標記的ABCA4固定在裝有Rho1D4抗體的基質上，以鑒定其對天然配體（即視網膜的加合物）的親和力，然后通過添加ATP來釋放。將CD81蛋白整體固定在涂有Rho1D4抗體的平板上，它表現出和分離可溶蛋白片段與丙型肝炎病毒包膜E2蛋白相同的親和結合力。另外還可通過SPR和放射性標記分析CB2與配體結合，或將CB2重構進脂質體的進行G蛋白活化的測定。另外，有陰離子轉運載體AE1結構域的重組蛋白被標記且用Rho1D4系統純化后表現出與紅細胞來源的AE1蛋白有相同的硫酸外排速率。

表1.文獻中報道的用rho1D4系統純化的膜蛋白的純度和產率的實例。盡管用Rho1D4系統純化的許多蛋白質都是G蛋白偶聯受體，但該系統也適用于純化其他膜蛋白（如轉運蛋白）。IAC：免疫親和層析; IMAC：固定化金屬親和層析; SEC：分子排阻色譜。
 
Rho1D4系統入門

由于在異源宿主中表達時，不同的蛋白對于去垢劑及純化柱的反應各不相同，所以在使用rho1D4系統純化膜蛋白時需要對一些實驗方法進行優化，那么找到所有必須的步驟并制定出優秀的實驗方案顯得尤為重要。以下4個步驟可幫助您快速有效地運用rho1D4系統純化目的蛋白。如果需要我們幫助您進行優化，請與我們聯系。
第一步，您的目標蛋白需要與Rho1D4標簽融合，您可以將此標簽帶在目的蛋白C-或N-末端，建議選擇對蛋白質活性影響很小的位置。
第二步，原核和真核系統在表達目的蛋白時具有不同的優勢，需要進行反復試驗篩選優秀的表達條件以找到合適的表達系統。在細菌系統（大腸桿菌）表達蛋白質需要對宿主，培養基，溫度以及誘導時間的進行優化。
第三步，去垢劑用于溶解膜蛋白，選擇優秀的去垢劑對目標蛋白后續的純化至關重要。可對各種常用去垢劑進行篩選。
第四步，純化Rho1D4標記的蛋白質時，需要與Rho1D4抗體偶聯的親和基質和競爭性洗脫用的Rho1D4肽。
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