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反相色譜是迄今在高效液相色譜中應用較廣泛的技術，主要是因為它適用于分析極大多數的非極性物質和很多的可離子化的及離子化合物。大多數用于反相色譜的固定相都是天然的疏水物質，因此，分析物是按照它們與固定相的疏水相互作用的大小來分離的，含有疏水的機制也能以同樣的保留方式分離。
反相色譜柱利用各種流動相和添加物可以有很多的應用，一些技術利用添加物可以改變或修飾填料的表面，有時候這些添加物有可能會污染鍵合相表面。
硅膠表面因為有著疏水鍵合相而有一些別的化學性質，殘留的硅烷醇存在于所有的硅膠鍵合填料中，這些硅烷醇具有弱酸性，因此能與某些待分析物合基質成分，特別是堿性成分。因為硅烷醇的pKa值大約是4.5，離子化能在中性pH條件下發生因此與陽離子產生靜電相互作用就有可能發生。較老的A型硅膠能容納高濃度金屬離子（有時候100ppm或更多），而這能使硅膠表面的酸性更大甚至能發生金屬鰲合現象或清除一些化合物。殘留硅烷醇在非末端封閉的硅膠合短鏈鍵合相如C2或C4上更讓人煩惱。
反相色譜柱使用者必須清楚他們所用的固定相表面特殊性質和可能的分析物－固定相表面的相互作用，這樣當他們使用反相方法時才能考慮到可能的基質相互作用。例如，非常疏水的樣品基質如玉米油，高芳香物質，和蠟能粘住固定相裝填表面并且改變他們的性質。含有蛋白質物質的生物流體也能吸附在裝填表面。盡管分析者想盡最大努力來保護HPLC柱子，某些分析物－基質污染能使固定相受到有害的影響。
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