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1、配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的凍存培養液；
2、取對數生長期的細胞，去除舊培養液，用PBS清洗。
3、去除PBS，加入適量胰蛋白酶（覆蓋培養皿表面）把單層生長的細胞消化下來；
4、離心1000rpm，5min；
5、去除胰蛋白酶，加入適量配制好的凍存培養液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，計數，調節凍存液中細胞的最終密度為5×106/ml～1×107/ml；
6、細胞分裝入凍存管中，每管1～1.5ml；
7、在凍存管上標明細胞的名稱，凍存時間及操作者；
8、凍存：標準的凍存程序為降溫速率-1～-2℃/min；當溫度達-25℃以下時，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃時，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱2h，然后放入-70℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內。
注意事項
1、從增殖期到形成致密的單層細胞以前的培養細胞用于凍存，最好為對數生長期細胞。在凍存前一天最好換一次培養液；
2、將凍存管放入液氮容器或從中取出時，要做好防護工作，以免凍傷；
3、凍存和復蘇最好用新配制的培養液。
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