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共聚焦顯微鏡中的圖像是來自一個焦平面的光通過針孔數碼相機聚焦拍攝，從而規避來自其支點上方或下方的光。固定在設備上的激光連續聚焦在樣品的選定區域，同時，被樣品吸附的熒光染料也會被數碼相機捕捉。共聚焦設備包含兩個旋轉鏡頭用來拍攝組圖。
然后通過所累積的不同焦平面的圖像序列，使用軟件編譯完整的3d圖像。此圖像可以在軸向（z軸）和橫向（x和y軸）平面進行微調。這些細胞和其他矩陣的再現是通過使用雙倒置的光錐照亮物體來實現的。
使用標準落射熒光顯微鏡所存在的問題是當遇到較厚的基質或標本時所表現出的熒光程度較大。大于2微米的樣品發出的輻射會危及生成圖像的準確性，從而損失成像的細節。而共聚焦顯微鏡則可以通過縮小激發范圍并使用光學切片來消除背景噪聲。
細胞外基質(ECM)或屬于所有細胞的非細胞成分，在細胞功能中是不可少的。ECM的彈性調節細胞的許多生物學功能，例如間充質干細胞的分化、粘附和遷移。
細胞生物學中常常通過水凝膠來模擬ECM。共聚焦顯微鏡的應用主要在于可與聚丙烯酰胺凝膠的壓痕法結合使用。共聚焦自動圖像成像可以有效測量ECM模擬中的壓痕和穿孔。比如，共聚焦激光顯微鏡可以測量出PAAM凝膠組合物的深度和剛度。這種方法可以替代AFM納米壓痕法和微針法。
由于共焦成像可以可靠地探測大多數樣品表面下方0-200µm之間的任何位置。然而，重要的是要注意，每個樣本都有自己的深度，在該深度處散射、光漂白和噪聲太高。據說有些標本應該*避免使用共聚焦顯微鏡。
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