急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是一種肺部炎癥性損傷，其特點是急性呼吸衰竭，可導致肺順應性和 CO2突然下降，肺容積減少，導致低氧血癥和呼吸窘迫。但是，ARDS的發病機制目前尚不清楚。

間充質干細胞是從骨髓和其他組織中分離出來的非造血干細胞，具有免疫調節和再生特性，可直接抑制疾病對器官的損害或通過減少細胞死亡間接抑制有害因子的釋放，有效避免炎癥發生，組織損傷和器官衰竭惡化。有研究指出，ARDS患者靜脈輸注間充質干細胞可通過釋放多種生物活性因子，與受損組織相互作用，減輕肺損傷，改善患者的長期肺功能。

另一方面，研究表明，MSCs的局部應用可通過CXCL12/CXCR4信號軸促進內源性細胞增殖、血管生成和裂解，參與創面修復過程。CXCL12 是一種關鍵趨化因子，參與多種穩態過程，如神經調節、胚胎發生、血管和淋巴細胞形成，其表達在組織愈合和傷口愈合過程中上調。此外，CXCL12 是 CXCR4 的趨化因子配體，CXCR4 常在造血干細胞、淋巴細胞和骨髓內皮細胞的細胞膜上表達。CXCL12 與 CXCR4 結合后，調節多種信號通路，包括基因轉錄、細胞增殖、存活和凋亡，并參與免疫缺陷、炎癥性疾病和癌癥的發展。

ARDS 患者常表現出廣泛的肺泡上皮損傷和炎癥性水腫。最新研究表明，細胞凋亡和裂解是 ARDS 肺泡損傷的關鍵特征，可能與肺泡血管內皮損傷有關。

湖南省湘潭市中心醫院外科重癥監護室課題組的一項研究以 TNF-α 刺激肺細胞凋亡構建 A549/MSCs 體外共培養模型，并通過尾靜脈注射 MSCs 構建 LPS 誘導的 ARDS 小鼠模型。通過敲低CXCL12和CXCR4的表達，探討MSCs對ARDS細胞凋亡的影響。研究發現MSCs抑制ARDS引起的肺泡上皮細胞凋亡，揭示了MSCs在肺泡上皮細胞中的作用是通過CXCL12/CXCR4軸調控的機制。

TNF-α誘導A549細胞凋亡和裂解并抑制細胞增殖

A549細胞（肺癌人類肺泡基底上皮細胞）用25 ng/ml TNF-α（腫瘤壞死因子-α）處理，體外建立急性肺損傷模型。CCK-8和Celltiter-Lumi檢測顯示，細胞增殖和活力呈時間依賴性下降（圖1 a-b）。與對照組相比，TNF-α組ROS、MDA水平升高，SOD、GSH-px水平降低（圖1 c-d），Caspase 1、Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9的活性顯著增強（圖1 e）。蛋白質印跡檢測顯示，TNF-α組Caspase 1、Cleaved Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9、Caspase 11、Bax、GSDMD表達上調，而Bcl-2、p-ERK1/ 2、WNT、β-catenin、Cyclin D1表達下調（圖1 f）。這些結果表明，TNF-α增強了A549細胞的凋亡、裂解和氧化，但降低了抗氧化水平和細胞增殖。

圖1   TNF-α誘導A549細胞凋亡。

（a）CCK-8 檢測細胞增殖；（b）Celltiter-Lumi 檢測細胞活力；（c）細胞氧化水平檢測；（d）細胞氧化應激水平檢測；（e）Caspase 活性檢測；（f）蛋白質表達的蛋白質印跡檢測。

MSCs通過CXCL12/CXCR4軸抑制TNF-α誘導的細胞凋亡和裂解，促進細胞增殖

CCK-8 和 Celltiter-Lumi 檢測到 MSCs 處理逆轉了細胞增殖和活力的下降（圖2 a-b）。蛋白質印跡結果顯示，MSCs組中Caspase 9、Caspase 11、Bax和GSDMD表達下調，Bcl-2、p-ERK1/2、WNT、β-catenin和Cyclin D1表達上調（圖2 c）。與 MSCs 共培養后，TNF-α 處理的 A549 細胞中 ROS 和 MDA 水平升高，SOD 和 GSH-px 水平降低（圖2 d-e），Caspase 1、Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9的活性受到抑制（圖2 f）。ELISA顯示，TNF-α處理后A549細胞中CXCL12的表達上調（圖2 g）。

圖2   MSCs 抑制 TNF-α 誘導的細胞凋亡。

（a）CCK-8 檢測細胞增殖；（b）Celltiter-Lumi 檢測細胞活力；（c）蛋白質表達的蛋白質印跡檢測；（d）細胞氧化水平檢測；（e）細胞氧化應激水平檢測；（f）Caspase 活性檢測；（g）A549 細胞培養基中 CXCL12 的 ELISA 檢測。

MSCs 通過 CXCL12/CXCR4 軸減少 ARDS 肺組織的病理損傷

在熒光顯微鏡下，實驗發現，shCXCL12 + shCXCR4組肺組織中MSCs的數量明顯少于shCXCL12 + MSCs組和shCXCR4+ MSCs組（圖3 a）。此外，shCXCL12 + shCXCR4組小鼠肺組織表現出廣泛的間質水腫、出血和炎性細胞浸潤，肺泡間隔纖維組織增生，肺泡壁增厚，肺泡結構嚴重受損。MSCs明顯減輕了肺組織的病理損傷，減少了膠原纖維。

小鼠肺損傷評分和肺纖維化評分顯著降低，敲低CXCR4或CXCL12可逆轉MSCs對ARDS小鼠的治療作用（圖3 b-d）。shCXCL12 + shCXCR4組血清ROS、MDA水平升高，SOD、GSH-px水平降低（圖3 e-f）。Caspase 1、Caspase 3、Caspase 8 和 Caspase 9 活性的抑制被逆轉（圖3 g）。與MSCs組、shCXCR4或shCXCL12組相比，shCXCL12 + shCXCR4 組血清IL-1β、TNF-α水平升高，IL-10水平降低（圖3 h）。在shCXCL12 + shCXCR4 組小鼠組織中，Caspase 1、Cleaved Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9、Caspase 11、Bax、GSDMD的表達上調，Bcl-2、p-ERK1/2、WNT、β-catenin、x Cyclin D1 的表達下調（圖3 i）。在敲除CXCR4或（和）CXCL12的表達后，MSCs對ARDS小鼠的肺組織失去了修復作用。

圖3   MSCs 減少了 ARDS 肺組織的病理損傷。

（a）熒光觀察小鼠肺組織中 MSCs 的分布；（b）HE染色觀察小鼠肺組織的病理變化和纖維化情況；（c）Masson染色觀察小鼠肺組織的病理變化和纖維化；（d）小鼠肺損傷評分和肺纖維化評分；（e）組織氧化水平檢測；（f）組織氧化應激水平檢測；（g）Caspase 活性檢測；（h）ELISA 檢測小鼠血清炎癥相關因子；（i）蛋白質表達的蛋白質印跡檢測。

圖4 圖形概要

總之，該結果表明 TNF-α 增強了 A549 細胞的凋亡、裂解和氧化，但降低了抗氧化水平和細胞增殖。此外，MSCs可通過CXCL12/CXCR4信號軸抑制TNF-α誘導的細胞凋亡和裂解，促進細胞增殖，減輕ARDS肺組織的病理損傷。綜上所述，MSCs可通過CXCL12/CXCR4信號軸抑制TNF-α和LPS誘導的肺細胞凋亡，從而改善ARDS小鼠肺組織損傷和肺纖維化。這些發現為 ARDS 中 MSCs 的干預目標提供了新的見解。

參考文獻：He X, Li C, Yin H, Tan X, Yi J, Tian S, Wang Y, Liu J. Mesenchymal stem cells inhibited the apoptosis of alveolar epithelial cells caused by ARDS through CXCL12/CXCR4 axis. Bioengineered. 2022 Apr;13(4):9060-9070. doi: 10.1080/21655979.2022.2052652. PMID: 35301927; PMCID: PMC9161978.

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