流式熒光檢測(cè)技術(shù)又叫液相懸浮芯片技術(shù)，自誕生以來(lái)，由于其靈敏而準(zhǔn)確的光學(xué)編碼鑒別、快速的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、靈活的檢測(cè)項(xiàng)目組合、可實(shí)現(xiàn)定量分析以及同時(shí)適用于蛋白與核酸分子檢測(cè)等特點(diǎn)而成為理想的多重指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)的技術(shù)平臺(tái)。

利用液相懸浮芯片技術(shù)高通量檢測(cè)抗原的原理如圖1所示，在特定熒光編碼的微球上分別連接對(duì)應(yīng)的能特異性捕獲抗原的抗體用于捕獲溶液中的抗原。當(dāng)檢測(cè)樣品中存在這些抗原時(shí)，這些連接在熒光編碼微球表面的捕獲抗體將會(huì)與其結(jié)合，最后通過(guò)加入藻紅蛋白（PE）標(biāo)記的特異性檢測(cè)抗體，形成微球連接的捕獲抗體-抗原-PE標(biāo)記的檢測(cè)抗體復(fù)合物。在流式細(xì)胞儀藻藍(lán)蛋白（APC）和藻藍(lán)蛋白-Cy7（APC-Cy7）通道下，微球被識(shí)別并用于判定檢測(cè)何種抗原；在流式細(xì)胞儀PE通道下，微球體上PE的熒光強(qiáng)度與樣本中各被檢測(cè)物的濃度呈正相關(guān)，各校準(zhǔn)品與其對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)可擬合成濃度—熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)曲線方程可計(jì)算出各抗原的濃度。熒光編碼微球制備技術(shù)是流式熒光法的核心，然而這項(xiàng)技術(shù)由于技術(shù)門檻高，國(guó)內(nèi)該領(lǐng)域技術(shù)薄弱，一直被外國(guó)公司“卡脖子”（圖2為國(guó)外兩大基于懸浮芯片檢測(cè)的產(chǎn)品）。

圖1流式熒光法高通量檢測(cè)細(xì)胞因子原理示意圖（以6細(xì)胞因子檢測(cè)為例）。

圖2進(jìn)口兩大基于懸浮芯片的檢測(cè)產(chǎn)品

2012年，一位做生物材料的博士和另一位做生物檢測(cè)的博士一碰頭，于是誕生了做國(guó)產(chǎn)化懸浮芯片的念頭。十年過(guò)去，這小小的念頭就像一顆種子，一步步生根，發(fā)芽，茁壯成長(zhǎng)，成為了現(xiàn)在的專業(yè)做磁性熒光編碼微球和高通量蛋白及核酸檢測(cè)的碧芯生物科技。

圖3碧芯生物科技Beadstar-mPlex^TM系列產(chǎn)品發(fā)展史

在不斷的技術(shù)研發(fā)中，我們摸索出了一套自己的技術(shù)，制備出了各方面性能不亞于進(jìn)口微球的Beadstar-mPlex^TM系列磁性熒光編碼微球，實(shí)現(xiàn)了單一粒徑編碼近60種（圖4所示）、兩種粒徑編碼超過(guò)100種的磁性熒光編碼微球，這個(gè)編碼重?cái)?shù)雖不及頂尖進(jìn)口公司那么多，但也足夠滿足目前的臨床和科研使用需求了。在深入的研究中，我們發(fā)現(xiàn)微球與熒光抗體的非特異性吸附會(huì)產(chǎn)生一定程度的噪音（指在檢測(cè)中當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品濃度為零時(shí)微球在PE通道的熒光值減去微球本底熒光值）。當(dāng)噪音較高時(shí)會(huì)嚴(yán)重影響檢測(cè)的靈敏度并使得一些低值樣本在檢測(cè)中出現(xiàn)偏差，然而直至今日，這個(gè)問(wèn)題并沒(méi)有引起同行的足夠關(guān)注。基于此，我們把關(guān)注點(diǎn)放在如何有效降低微球與熒光檢測(cè)蛋白的非特異性吸附上，經(jīng)過(guò)一系列艱難而又持久的摸索，我們最終采用優(yōu)化的配方來(lái)降低磁性熒光編碼微球表面對(duì)熒光檢測(cè)抗體的非異性吸附，這種低吸附的性能使得我們的微球在開(kāi)發(fā)的相關(guān)下游產(chǎn)品中具有比進(jìn)口同類產(chǎn)品更高的檢出率。

圖4單一粒徑的60種磁性熒光編碼微球

在磁性熒光編碼微球的不斷優(yōu)化的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步開(kāi)發(fā)了基于低吸附熒光編碼微球的下游產(chǎn)品—Beadstar-mPlex^TM多細(xì)胞因子聯(lián)檢試劑盒（包括人類12細(xì)胞因子聯(lián)檢試劑盒以及小鼠10因子聯(lián)檢試劑盒）。以人類12細(xì)胞因子聯(lián)檢試劑盒為例，可在單個(gè) 25 µL 血漿、血清、細(xì)胞培養(yǎng)上清液和其他體液樣品中同時(shí)定量檢測(cè)IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-8、IL-6、IL-10、IL-12p70、IL-17A、TNF-α、IFN-γ、IFN-α2的濃度。與進(jìn)行傳統(tǒng)的夾心ELISA相比，基Beadstar-mPlex^TM多細(xì)胞因子聯(lián)檢試劑盒可以在同等時(shí)間內(nèi)使用明顯更少的樣品分析多達(dá) 12倍的分析物。與進(jìn)口同類試劑相比，Beadstar-mPlex^TM多細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒不僅有與之媲美的線性范圍（圖5）、靈敏度、重復(fù)性，還兼具低吸附磁性熒光編碼微球優(yōu)勢(shì)——低噪音。

圖5碧芯生物Beadstar-mPlex^TM12細(xì)胞因子聯(lián)檢試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線圖（5 parameter logistic fitting, R²均不小于0.99）；

在實(shí)際檢測(cè)中，由于正常人的血清中細(xì)胞因子濃度較低，目前大部分試劑對(duì)正常人血清中各細(xì)胞因子的檢出率不高（幾大主流國(guó)際品牌對(duì)正常人血清細(xì)胞因子檢出率不足50%）。究其原因，主要是熒光編碼微球?qū)晒鈾z測(cè)抗體的非特異吸附較強(qiáng)，導(dǎo)致噪音較高。如圖6所示，當(dāng)檢測(cè)低值血清樣本中，血清中存在復(fù)雜的蛋白質(zhì)體系，不可避免這些蛋白質(zhì)同樣會(huì)與微球產(chǎn)生非特異性吸附，從而與熒光檢測(cè)抗體競(jìng)爭(zhēng)非特異性吸附位點(diǎn)，使最終的熒光檢測(cè)值并不能正確反映體系中細(xì)胞因子的濃度，甚至出現(xiàn)熒光值小于標(biāo)準(zhǔn)品濃度為零時(shí)的值，無(wú)法計(jì)算細(xì)胞因子的濃度。因此減少熒光編碼微球?qū)晒鈾z測(cè)抗體的非特異性吸附可顯著提升低值血清樣本檢測(cè)的準(zhǔn)確性、提升檢出率。碧芯生物Beadstar-mPlex^TM多細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒采用的磁性熒光編碼微球通過(guò)自主研發(fā)的配方，讓我們的磁性熒光編碼微球具有更低的非特異性吸附，可顯著減少噪音（圖7）。實(shí)際血清樣本的結(jié)果也證實(shí)，碧芯生物的Beadstar-mPlex^TM多細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒的檢出率要優(yōu)于進(jìn)口細(xì)胞因子聯(lián)檢試劑盒。

圖6非特異性吸附導(dǎo)致血清樣本檢測(cè)率低的原理示意圖

                                       圖7碧芯生物Beadstar-mPlex^TM與國(guó)外同類試劑的噪音對(duì)比

一路走來(lái)，碧芯生物始終堅(jiān)定不移的以“建立民族品牌，推進(jìn)進(jìn)口試劑國(guó)產(chǎn)化進(jìn)程”為己任，力爭(zhēng)成為生命科技領(lǐng)域具有國(guó)際影響力的公司，為人類的健康事業(yè)做出貢獻(xiàn)。