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反相色譜的影響因素：
(1)柱長
有機小分子和肽類的分辨率隨柱長的增加而增加.但是柱長增加并不能使蛋白質和核酸等生物大分子的分辨率顯著增加.它們在較短的柱子上往往也有很好的分離效果。
(2)流動相的流速。
有機小分子和肽類的分辨率對流動相流速非常敏感。而蛋白質和核酸等生物大分子的分辨率則不然。流速越小，柱子越長，色譜峰的寬度就越大，分辨率就越小。制備色譜上樣過程中的流速對動態吸附容量影響很大。
(3)溫度。
溫度上升，流動相黏度下降，流動速度加快，且流動相與固定相之間的傳質速度加快，使分辨率增加。同時，溫度上升，分子熱運動增加，疏水性作用減弱。升高溫度要考慮目標物質的熱穩定性。
(4)流動相組成。
流動相的極性越大，溶質的分配系數越大，洗脫時間越長。RPC多采用降低流動相極性(水含量)的線性梯度洗脫法。水是極性強的溶劑，在反相色譜中常常和基礎溶劑配合使用，向流動相中加入不同濃度的、可以與水混溶的有機溶劑，以得到不同強度的流動相，這些有機溶劑稱為修飾劑。反相色譜中常用的有機溶劑有甲醇和乙腈。此外，乙醇、四氫呋喃、異丙醇及二氧六環也常被用作修飾劑。有機溶劑梯度的大小也會影響分辨率，一般梯度越小，分辨率越大。
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