細胞培養前的準備

無菌操作

提前開啟紫外照射30min消毒滅菌，工作臺開燈通風10min，用75%酒精擦拭臺面，并開啟超凈工作臺風扇運轉數分鐘后，才開始實驗操作。

每次操作只處理一株細胞株，避免細胞間交叉污染。

實驗完畢后，將實驗物品帶出工作臺，再次以 75% 酒精擦拭無菌操作臺面。實驗操作應在中央無菌區域，一般不要再邊緣區域操作。

器材耗材備足

在開始細胞培養之前，先檢查一下移液管和瓶子的數量是否充足，以免在開始實驗后再次出入操作臺，這樣可以降低細胞污染的風險。

細胞培養基也應先預熱，選擇只預熱部分培養基而非整瓶加熱，不但可以節約實驗時間，而且可以避免因反復加熱培養基而造成的蛋白質降解。

結束操作后，需盡可能避光保存。

細胞培養的定期檢查

定期檢查培養細胞的形態，即形狀和外觀，對于細胞培養實驗取得成功至關重要。

a.檢查培養液顏色與透明度的變化，顏色變黃，說明PH值下降；變紅或紫紅色，說明PH值上升，細胞生長停滯、死亡，一般生長穩定的細胞2-3天換液一次，生長緩慢的細胞可3-4天換液一次。

b.觀察細胞生長狀態，細胞長滿瓶底的80-90%，應及時傳代。

c.觀察細胞形態變化，細胞透明度大、折光性強、輪廓清晰為佳。

除確認細胞的健康狀態外，每次操作細胞時通過肉眼和顯微鏡檢查細胞還可早期發現污染征象，避免污染擴散至實驗室其他細胞。

注意微生物污染，常常出現培養液混濁，液體內漂菌絲或細胞菌，不僅僅指微生物，包括所有混入培養環境中的細胞生存有害的成分和造成細胞不純的異物及細胞。

細胞變質的征象

細胞變質的征象包括核周出現顆粒、細胞與基質解離以及細胞質空泡形成。

這些變質征象可能為多種原因所致，例如：培養物污染、細胞系衰老或培養基中存在毒性物質，或者這些征象僅表明培養物需要更換培養基。

變質嚴重時將會成為不可逆的變化。

細胞培養通風櫥的消毒及布局

a.保持細胞培養通風櫥內的整潔有序，將所有物品置于直視范圍內。

b.向放入通風櫥內的所有物品噴灑70%乙醇，擦拭清潔進行消毒。

c.在通風櫥中部開闊處放置細胞培養容器；移液器置于右前方易于取用；試劑和培養基置于右后方便于吸取；試管架置于中后部；小型容器置于左后部用于盛放廢液。

培養瓶/皿等物品的無菌操作

無菌培養瓶、試劑瓶、培養皿等物品使用時方可揭開蓋子，不得將其開放暴露于環境中，操作完成后盡快蓋上蓋子，取下蓋子時應將蓋子開口朝下放在工作臺面上。

進行無菌操作時不要說話、唱歌或吹口哨。盡快完成實驗，以盡量避免污染。

細胞培養中可能的污染物

細胞培養污染物主要分為兩類

a.化學污染物,如培養基、血清和水中的雜質、內毒素、增塑劑和去污劑。

b.生物污染物，如細菌、霉菌、酵母、病毒、支原體以及其他細胞系的交叉污染。

可通過充分了解污染源以及采用良好的無菌技術，降低污染發生的頻率和嚴重程度。

細胞培養污染篩查

細胞被污染了途徑有以下幾個

a.空氣是微生物傳播的最主要途徑，操作時盡量避免說話、咳嗽、打噴嚏；

b.使用的培養器械及器皿清洗消毒；

c.培養兩種以上細胞時，操作不規范，可能導致細胞交叉污染；

d.血清有問題，可能血清在生產時就已經被支原體或病毒污染；

e.原代培養的污染多數來源于組織樣本。

交叉污染的確認

交叉污染雖不如微生物污染普遍，但與HELA細胞及其他生長迅速的細胞系間廣泛的交叉污染是個明確的問題，會造成嚴重后果。

從聲譽好的細胞庫獲取細胞系、定期檢查細胞系性質及采用良好的無菌技術有助于避免交叉污染。

通過DNA指紋圖譜、核型分析和同位素分析可確認有無交叉污染。

細胞換液注意事項

為細胞換液時，要沿著培養瓶的一側輕輕地加入，而不是直接加到細胞中，以免損傷細胞，當培養的細胞株較為脆弱時尤其需要注意。

使用無菌玻璃吸管或一次性塑料吸管和移液器操作液體時，每支吸管只能使用一次，以免交叉污染。

細胞傳代的時間把握

當細胞呈指數增殖，貼壁培養的細胞已占據所有可用基質、沒有擴增空間，或懸浮培養的細胞已超過培養基質所支撐的能力，無法進一步生長時，細胞增殖速度將大大降低甚至停止。

細胞培養中使用抗生素的注意事項

細胞培養時不應長期使用抗生素，因為連續使用抗生素會促進抗生素耐藥性細胞株的產生，導致輕度污染持續存在。抗生素只能作為對付污染的最后手段短期使用，并盡快撤除。

如果長期使用抗生素，則應同時進行無抗生素培養，以便作為鑒別隱性感染的對照。

細胞凍存的必要性

連續培養的細胞系容易發生遺傳漂變，有限細胞系最終會發生衰老，所有培養的細胞都易受到微生物污染，即使運轉情況好的實驗室也會遇到設備故障的問題。

由于已建立的細胞系是一種寶貴資源，更換細胞系成本高昂，而且耗費時間，因此，必須將其冷凍起來，長期保存。

細胞凍存的事項

應在細胞濃度高的情況下進行細胞培養凍存，并且細胞傳代的次數盡可能少。

在凍存前確保活細胞的百分比至少為90%。

請注意，最佳凍存條件取決于所用細胞系。

凍存和復蘇過程對大多數細胞都會造成不利影響，因此不要通過渦旋震蕩或者用。