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實時定量PCR技術（real-time PCR）也叫qPCR（Quantitave PCR），是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過特定數(shù)學原理對未知模板進行定量分析的方法。它是一項臨床上非常成熟的技術，目前在分子生物學領域，qPCR核酸定量好方法。目前仍在全球肆虐的SARS-CoV-2鑒定的“金標準”——核酸檢測就是通過qPCR原理進行的。
圖1 qPCR技術原理簡圖（圖片來自henrik's lab）
那么拿到一個樣本，需要經(jīng)過以下多項操作流程才能定量檢測到它的核酸含量。其中任何一個步驟操作失誤都會導致它的檢測結果出現(xiàn)異常，那讓小愛來帶您來看下出現(xiàn)常見問題的解答，為您解決qPCR實驗中的痛點！
圖2 qPCR實驗操作流程圖
FAQ:
1、無Ct值出現(xiàn)a) 檢測熒光信號的步驟有誤：一般染料法采用72℃延伸時采集，探針法則一般在退火結束時或延伸結束采集信號。
b) 引物或探針降解：可通過PAGE電泳檢測其完整性。
c) 模板量不足：對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起。
d) 模板降解：避免樣品制備中雜質的引入及反復凍融的情況。
e) 反應循環(huán)數(shù)不夠：一般都要在35個循環(huán)以上，可根據(jù)實驗情況增加循環(huán)，但高于45個循環(huán)會增加過多的背景信號。
2、Ct值出現(xiàn)過晚
a) 擴增效率極低：優(yōu)化反應條件，嘗試三步法擴增程序，或者重新設計引物。
b) 模板濃度太低：減少稀釋度，重復實驗。
c) 模板降解：重新制備模板，重復實驗。
d) PCR產(chǎn)物太長：一般將PCR產(chǎn)物長度設計為100 bp-200 bp之間。
e) 反應體系中存在PCR反應抑制劑：一般為加入模板時帶入，導致模板質量不高，加大模板稀釋倍數(shù)或者重新制備模板重復實驗。
3、陰性對照出現(xiàn)明顯擴增
a) 反應體系組分（如水）被污染：實驗過程中，更換新的Mix或者水重復實驗。
b) 標本間的交叉污染或產(chǎn)物污染：反應體系在超凈工作臺內配制，對實驗室進行嚴格的區(qū)分，減少氣溶膠污染；使用帶濾芯的槍頭。
c) 引物二聚體的出現(xiàn)：引物設計不夠優(yōu)化：應避免引物二聚體和發(fā)夾結構的出現(xiàn)。
d) 引物濃度不佳：適當降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。在35循環(huán)后陰性對照出現(xiàn)擴增屬正常情況，可配合熔解曲線進行分析。
4、熔解曲線出現(xiàn)多峰
a) 非特異性擴增。
b) 引物設計不佳：避免二聚體和發(fā)夾結構的出現(xiàn)。
c) 引物濃度不佳：適當調整引物濃度。
d) 退火溫度低：提高退火溫度。
e) 模板中有基因組DNA的污染：RNA提取過程中避免基因組DNA的污染（DNaseI處理），或通過設計引物避免非特異性擴增。
5、出現(xiàn)引物二聚體
a) 優(yōu)化擴增條件，如提高退火溫度，可利用梯度PCR，摸索最佳的Tm值。通常兩步循環(huán)(由95℃變性步驟直接進入60℃退火和延伸步驟)有利于強效擴增，因此引物設計時設定的成功退火溫度為60°C。
b) 引物濃度太高，適當降低引物濃度。
c) 可通過瓊脂糖凝膠電泳確認引物二聚體。引物二聚體在凝膠的底部形成擴散條帶，通常位于100 bp以下。
6、擴增效率低
a) 反應試劑中部分成分特別是熒光染料降解。
b) 反應條件不佳：適當降低退火溫度或改為三步擴增法。
c) 反應體系中有抑制物：一般為模板中引入，應先把模板適當稀釋，再加入到體系中，減少抑制物的影響。
7、實驗重復性差
a) 加樣體積失準：使用性能較好的移液槍，擴大反應體積，將模板做高倍稀釋，以大體積加入反應體系中。
b) 定量PCR儀不同位置溫度控制不一致：定期校準儀器。
c) 模板濃度太低：模板濃度越稀，重復性越差，減少模板稀釋度或提高加樣體積。
d) qPCR mix沒有混勻，請使用前充分混勻。
除了實驗操作的解答外，愛必信擁有全套qPCR解決方案來一站式幫您解決qPCR實驗難題。
類別 | 貨號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
樣本保存 | abs9268 | RNA樣品保存液 | 100mL |
abs60330 | RNA保護因子 | 50T | |
RNA提取純化 | abs9331 | Trizol(總RNA抽提試劑) | 100mL |
abs60027 | 組織/細胞RNA快速提取試劑盒(Dnase I) | 50T | |
abs60030 | 病毒基因組DNA/RNA快速提取試劑盒 | 50T | |
abs60028 | 植物RNA快速提取試劑盒(DNase Ⅰ) | 50T | |
abs60029 | 全血RNA快速提取試劑盒(Dnase I) | 50T | |
逆轉錄 | abs60073 | Reverse Transcriptase | 10000U/10000U×5 |
abs60076 | Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix (gDNA Purge) | 50T/100T | |
abs60246 | 逆轉錄一管化三代預混液 | 100T | |
qPCR | abs60309 | 一步法超級多重熒光定量PCR試劑盒(探針) | 100T/250T |
abs60310 | 一步法超級熒光定量PCR試劑盒(探針) | 100T/250T | |
abs60093 | Multiplex Probe One Step qRT-PCR Kit | 100T/500T | |
abs60086 | SYBR High-Sensitivity qPCR SuperMix | 1mL×5/1mL×25 | |
abs60087 | SYBR qPCR SuperMix Plus(High ROX Premixed) | 1 mL×5/1mL×25 | |
abs60088 | SYBR qPCR SuperMix Plus(Low ROX Premixed) | 1 mL×5/1mL×25 | |
abs60247 | 抗體染料法定量PCR預混液(通用ROX) | 5×1mL | |
abs60303 | 染料法熒光定量PCR試劑盒(化學修飾) | 100T/200T/500T | |
abs60304 | 染料法熒光定量PCR試劑盒(抗體修飾) | 100T/200T/500T | |
abs60305 | 探針法熒光定量PCR試劑盒 | 100T/200T/500T | |
abs60306 | UDG探針法熒光定量PCR試劑盒(防污染系統(tǒng)) | 100T/200T/500T | |
abs60307 | 超級多重熒光定量PCR試劑盒(探針) | 100T/200T/500T | |
abs60308 | UDG多重探針法熒光定量PCR試劑盒(防污染系統(tǒng)) | 100T/200T/500T |
相關產(chǎn)品
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