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原理
將小鼠的胚胎成纖維細胞（MEF）從機體中取出，經胰酶、螯合劑（常用EDTA）處理，分散成單細胞，置MEF生長培養基中培養，使細胞得以生存、生長和繁殖。
材料與儀器
孕鼠
PBS EDTA 胰酶 MEF生長培養基 FBS 高糖DMEM
眼科直剪 眼科直鑷 眼科彎鑷 玻璃平皿3 尼龍濾網 離心管 手術刀片
PBS EDTA 胰酶 MEF生長培養基 FBS 高糖DMEM
眼科直剪 眼科直鑷 眼科彎鑷 玻璃平皿3 尼龍濾網 離心管 手術刀片
步驟
一、實驗材料準備
二、具體操作
1. 處死孕鼠，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超凈臺中用剪刀和鑷子將孕鼠皮膚剪開，用另外一組剪刀、鑷子剪開腹部肌層，露出子宮，最后用第三組剪刀和鑷子將子宮小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中，沖洗去血。
1. 動物
孕期14至16天的孕鼠(小鼠)。
2. 試劑
無Ca2+和Mg2+的PBS(D-PBS)、0.05%胰酶、0.53 mmol/L EDTA溶液、MEF生長培養基(高糖DMEM加10%FBS)。
3. 器械
眼科直剪3把、眼科直鑷3把、眼科彎鑷2把、玻璃平皿3套、200目尼龍濾網、50 ml和15 ml離心管和手術刀片。以上物品均需要高壓滅菌消毒處理。
二、具體操作
1. 處死孕鼠，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超凈臺中用剪刀和鑷子將孕鼠皮膚剪開，用另外一組剪刀、鑷子剪開腹部肌層，露出子宮，最后用第三組剪刀和鑷子將子宮小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中，沖洗去血。
2. 用兩把彎鑷子將胚胎外的胞膜小心去除，然后夾掉頭和內臟，將其余胚胎轉移到一個裝有30 ml D-PBS的50 ml離心管中，輕輕顛倒兩次，倒掉D-PBS，再重復此步驟一次，注意要留少許D-PBS，然后將胚胎轉移到另一裝有D-PBS的平皿中，并用手術刀片將其細細切碎。
3. 用200 ul的移液槍反復、快速地吹打平皿中的液體，轉移至15 ml離心管中，于4℃ 1500 rpm離心5分鐘，倒掉上清，以10 ml胰酶重懸沉淀，放在37℃水浴中消化30分鐘，且每隔五分鐘輕輕晃動，使之充分消化。
4. 將上層細胞懸液倒入一個裝有10 ml MEF生長培養基的50 ml離心管中，用200目的尼龍網過濾后，以1 500 rpm離心5分鐘收集細胞，再用30 ml MEF生長培養基洗滌兩次。
5. 細胞沉淀用15 ml MEF生長培養基重懸后進行細胞計數(一般8只14天的胎鼠可獲得2-3x107細胞)。
6. 3x106細胞懸浮于15 ml MEF生長培養基中，接種到200 ml培養瓶中。
7. 24小時后更換新鮮的MEF生長培養基。
8. 細胞長滿后，先用D-PBS沖洗，倒掉后加胰酶消化(此步時間不宜過長，作者一般不超過五分鐘)，按1:5傳代。
9. 細胞再次長到覆蓋率80-90%左右，將其消化后，常規凍存(凍存液要現配)。
小鼠胚胎成纖維細胞(MEF 100倍)
注意事項
1. 原代培養，一定要避免污染。
2. MEF生存能力有限，如果不凍存，體外存活十代左右。
3. 凍存后復蘇的細胞只能傳代一次，因為這些細胞繁殖能力有限。
4. 消化細胞時間不要過長。
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