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砷鉬酸比色法

來源:深圳市安培生物科技有限公司   2023年01月16日 15:24  

原理

還原糖是具有羰基(>C=O)的糖,能將其它物質還原而其本身被氧化。

(1) 還原糖在堿性條件及有酒石酸鉀鈉存在下加熱,可以定量地還原二價銅離子為一價銅離子,產生磚紅色的氧化亞銅沉淀,其本身被氧化。具體反應如下:


(2)氧化亞銅在酸性條件下,可將鉬酸銨還原,還原型的鉬酸銨再與砷-酸氫二鈉起作用,生成一種藍色復合砷鉬藍,其顏色深淺在一定范圍內與還原糖的含量(即被還原的Cu2O 量)成正比,用標準葡萄糖與砷鉬酸作用,比色后做標準,就可測得樣品還原糖含量。

材料與儀器

植物材料
銅試劑 砷鉬酸試劑 標準葡萄糖原液
分光光度計 具塞刻度試管 水浴鍋 刻度吸管 容量瓶 漏斗 研缽

步驟

1.標準曲線的制作:


在一系列刻度試管中,分別加入200μg/mL 標準葡萄糖0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5及0.6 mL,再順序加入蒸餾水2、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5 及1.4 mL,配成濃度分別為0、10、20、30、40、50 及60μg/mL 的系列葡萄糖溶液。每試管加入銅試劑2mL,混勻后沸水浴中加熱10min,立即冷卻,再加入2mL 砷鉬酸試劑,振蕩兩分鐘后稀釋到20mL,用分光光度計在620nm 波長下比色,測其光密度OD620nm(做一式兩份)。以糖濃度微克數為橫坐標,光密度OD620nm 為縱坐標,繪制標準曲線。


2.植物樣品中還原糖的提取:


將樣品洗凈,吸干其表面水分,切碎混勻,稱取1g 放入研缽中,加入約0.5g 石英砂,磨成勻漿,加水將樣品由玻璃漏斗沖入100mL 容量瓶中,加水達70-80mL,搖勻后置于80℃恒溫水浴上浸提0.5h。


待上述樣品冷卻后,沉淀蛋白質,加入5%硫酸鋅5mL,再慢慢滴入0.3mol/L Ba(OH)2 5mL,以沉淀蛋白質。振蕩后靜置,至上層出現清液后再加一滴Ba(OH)2,直至無白色沉淀時,向容量瓶加水至刻度。


3.還原糖含量的測定:


過濾上述已定容的樣品液,取5mL 濾液,再定容到100mL(此步視樣品的含糖量而定)。取已稀釋的溶液2mL,與標準葡萄糖顯色法相同:加銅試劑2mL,煮沸10min,加砷鉬酸試劑2mL,振蕩2mL,定容到15ml,620nm 波長下比色,記下光密度OD620nm(至少重復兩次)。

注意事項

比色皿的外面應被擦干凈。

常見問題

OD是當光經過一個樣本時,部分光會被吸收。在光譜學,透光率是出射光和入射光強度的比。


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