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原理
組織勻漿后懸浮在等滲介質(zhì)中進(jìn)行差速離心，是分離細(xì)胞器的常用方法。一個顆粒在離心場中的沉降速率取決于顆粒的大小、形狀、密度、離心力及介質(zhì)黏度等。同一離心場中，同一時間內(nèi)，密度和大小不同的顆粒沉降速率不同。依次增加離心力和離心時間，就能使非均一的懸浮液中的顆粒按其大小、密度先后分批沉降在離心管底部，從而可分批收集各種亞細(xì)胞成分。
材料與儀器
新鮮菠菜
氯化鈉
離心機(jī) 組織搗碎機(jī) 顯微鏡 天平 離心管 紗布 燒杯 量筒 滴管 載玻片、蓋玻片
氯化鈉
離心機(jī) 組織搗碎機(jī) 顯微鏡 天平 離心管 紗布 燒杯 量筒 滴管 載玻片、蓋玻片
步驟
一、實驗步驟
1. 選取新鮮的嫩菠菜葉，洗凈擦干后去除葉梗及粗脈，稱30 g 于150 ml 0.35 mol/L NaCI溶液中，裝入組織搗碎機(jī)。
1. 選取新鮮的嫩菠菜葉，洗凈擦干后去除葉梗及粗脈，稱30 g 于150 ml 0.35 mol/L NaCI溶液中，裝入組織搗碎機(jī)。
2. 利用組織搗碎機(jī)低速（5 000 r/min）勻漿3~5 min。
3. 將勻漿用6層紗布過濾于500 ml 燒杯中。
4. 取濾液4 ml 在1 000 r/min 下離心2 min。棄去沉淀。
5. 將上沾液在3 000 r/min下離心5 min。棄去上清液，沉淀即為葉綠體（混有部分細(xì)胞陔）。
6. 將沉淀用0.35 mol/L NaCI溶液懸浮。
7. 取葉綠體懸液一消滴于載片上，加蓋片后即可在普通光鏡和熒光顯微鏡下觀察。
（1）在普通光鏡下觀察。
（2）在熒光顯微鏡下觀察。
（3）取葉綠體懸液一滴滴在無熒光載片上，再漓加一滴0.01%吖啶橙熒光染料，加無熒光蓋片后即可以熒光顯微鏡下觀察。
菠菜葉手切片觀察用剖須刀將新鮮的嫩菠菜切削一斜面置于載片上，滴加1~2滴0.35 mol/L NaCI溶液，加蓋片后輕壓，置顯微鏡下觀察。
（1）在普通光鏡下觀察。
（2）在熒光顯微鏡下觀察。
（3）用同樣方法制片，但滴加1~2滴0.01%吖啶橙染液染色1 min，洗去余液，加蓋廾后即町以熒光顯微鏡下觀察。
二、實驗結(jié)果
1. 葉綠體的分離和觀察
（1）普通光鏡下，可看到葉綠體為綠色橄欖形，在高倍鏡下可看到葉綠體內(nèi)部含有較深的綠色小顆粒，即基粒。
（2）以O(shè)lympus熒光顯微鏡為例，在選用B(blue)激發(fā)濾片，B雙色鏡和O530（orange）阻斷濾片的條件下，葉綠體發(fā)出火紅色熒光。
（3）加入吖啶橙染色后，葉綠體可發(fā)出桔紅色熒光，而其中混有的細(xì)胞核則發(fā)綠色熒色。
2. 菠菜葉手切片觀察
（1）在普通光鏡下可以看到三種細(xì)胞
①表面細(xì)胞：為邊緣呈鋸齒形的鱗片狀細(xì)胞。
②保衛(wèi)細(xì)胞：為構(gòu)成氣孔的成對存在的腎形細(xì)胞。
③葉肉細(xì)胞：為排成柵狀的長方形和橢幽形細(xì)胞。
葉綠體呈綠色橄欖形，在高倍鏡下還可以看到綠色的基粒。
（2）在熒光顯微鏡下，葉綠體發(fā)出火紅色熒光，但其熒光強度要比游離葉綠體弱。氣孔發(fā)綠色熒光，兩保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)的火紅色葉綠體則環(huán)繞氣孔排列成一圈。表皮細(xì)胞內(nèi)葉綠體數(shù)量要比葉肉細(xì)胞少。
（3）用吖啶橙染色后，葉綠體則發(fā)出枯紅色熒光，細(xì)胞核町發(fā)出綠色熒光，氣孔仍為綠色。
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