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掃描探針顯微鏡的工作原理是基于微觀或介觀范圍的各種物理特性，通過原子線度的極細探針在被研究物質的表面上方掃描時檢測兩者之間的相互作用，以得到被研究物質的表面特性，不同類型的SPM之間的主要區別在于它們的針尖特性及其相應的針尖 樣品相互作用方式的不同。
工作原理來源于量子力學中的隧道貫穿原理。其核心是一個能在樣品表面上掃描、并與樣品間有一定偏置電壓、其直徑為原子尺度的針尖。由于電子隧穿的幾率與勢壘V(r)的寬度呈現負指數關系，當針尖和樣品的距離非常接近時，其間的勢壘變得很薄，電子云相互重疊，在針尖和樣品之間施加一電壓，電子就可以通過隧道效應由針尖轉移到樣品或從樣品轉移到針尖，形成隧道電流。通過記錄針尖與樣品間的隧道電流的變化就可以得到樣品表面形貌的信息。
使用掃描探針顯微鏡時的注意事項:
1、掃描探針顯微鏡是精密設備，要倍加愛護；
2、熟練掌握下針技巧后，才可以獨立操作；
3、針夾具取出后，一定倒置于濾紙上，要求放于衣袖碰觸不到的地方；
4、下針過程中注意觀察主機中的水平偏差值（Horiz）和垂直偏差（Vert），示值趨勢減小的為正常；
5、顯微鏡視場光斑打到樣品臺中心位置，保證樣品臺平整時，針在視場的中心位置；
6、手動下針調三軸調節鈕時，注意觀察水平偏差值（Horiz）和垂直偏差（Vert）；
7、自動下針完成后，在調節X,Y offset 確定掃描位置和范圍的時候，一定先將采樣頻率降低；
8、測試過程中，密切注意顯示 CRT 上針的狀態及軟件中可能出現超限提示的部分；
9、測試過程中，盡量保證環境氣流穩定，行走時要緩慢，輕輕關門。
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