分子診斷是指通過分子生物學的檢測手段，檢測患者體內基因結構或表達水平的技術。由于其檢測速度快、靈敏度高和特異性強等特點，被廣泛應用于血液篩查、 遺傳性疾病、傳染性疾病、腫瘤伴隨診斷等領域。比如現今與我們息息相關的新冠核酸檢測，就屬于分子檢測的應用實例。分子診斷的檢測往往需要標準品，作為對照，校正系統誤差，確保結果的準確性。下面景源實驗就和大家分享分子診斷的背景知識和標準品的應用意義吧！

應用于分子診斷中的檢測技術

分子診斷主要檢測基因的序列結構和表達水平，主要的檢測技術包括PCR、高通量測序、熒光原位雜交（FISH）、基因芯片等。其中，PCR與高通量測序等應用最為廣泛。

PCR技術的原理是以樣品DNA為模板，在聚合酶、引物和dNTP等擴增體系下復制出大量的子代DNA。第一代PCR通常在擴增后，采用瓊脂糖凝膠電泳對產物進行檢測，一般需要結合一代測序才能對基因型做定性分析。第二代熒光定量PCR（Real-Time PCR），也叫做qPCR，在反應體系中加入熒光物用于指示反應進程，利用熒光信號的變化來監測擴增產物的變化，通過熒光曲線來判斷結果，并可以借助Cq值和標準曲線來定量。第三代PCR 微滴式數字PCR（Droplet Digital PCR, DDPCR）也用于定量分析，相比于二代PCR靈敏度更高，能測定基因拷貝數。其原理是將反應體系分為成千上萬個納升級的微滴，其中每個微滴或不含待檢核酸靶分子，或者含有一個至數個待檢核酸靶分子。經過擴增后，再通過檢測熒光信號，并根據泊松分布原理及陽性微滴的個數與比例計算出模板數量。

二代測序由于通量高，在檢測多個樣品和多個位點時，能節省時間、降低成本，所以在分子診斷中有巨大的應用潛力。其原理是通過模板DNA 分子的化學修飾，將其錨定在納米孔或微載體芯片上，利用堿基互補配對原理，在 DNA 聚合酶鏈反應或 DNA 連接酶反應過程中，通過采集熒光標記信號或化學反應信號，實現堿基序列的解讀，一次性可完成幾十萬至上百萬條序列的測定。

分子診斷的應用領域

分子診斷的應用場景很多，如今主要應用的領域有無創產前檢測（NIPT）、伴隨診斷、腫瘤早篩和傳染病檢測等。

NIPT是通過高通量測序等手段，檢測母體內的胎兒遺傳信息，判別胎兒是否患染色體異常疾病，包括21 三體綜合征（唐氏綜合征）、18 三體綜合征（愛德華氏綜合征）、13 三體綜合征 （帕陶綜合征）。NIPT具有檢測準確率高、周期短、漏診率低和對母體損害低等優點。

伴隨診斷是分子診斷的另一個應用領域。在使用分子靶向藥前，需要先檢測患者是否存在藥物靶點，提高用藥的準確性。常用的檢測方法有PCR、NGS、FISH和免疫組化（IHC）等，其中PCR測序是常用的檢測手段，具有快捷準確等特點。

在腫瘤早篩中也會應用到分子診斷技術。腫瘤形成的其中一個重要原因是基因突變。因此盡早篩查出這類人群，開展預防和治療是很重要的。現階段多通過內鏡、組織活檢等手段檢測，但操作麻煩、準確性不高且存在漏篩。而基于 PCR、NGS 等分子診斷技術的液體活檢則具有很大的應用潛力，其原理是通過檢測從轉移灶釋放到血液中的腫瘤細胞或者DNA。具有取樣方便、靈敏度高、非侵入性、有效應對腫瘤異質性、在疾病發展的不同階段可重復取樣等優勢。

分子診斷在傳染病篩查的應用主要體現在新冠檢測和血液篩查。在新冠篩查中，主要應用qPCR檢測，能快速準確地篩查出感染者，是減少新冠傳播的有力手段，具有精準度高和辨識度強等特點。血液篩查是為了確保血液制品的質量、避免交叉污染和保護工作人員的安全，防止相關疾病的感染者進入供血隊伍。這些疾病包括：人類免疫缺陷病毒（HIV）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒 （HCV）、梅毒螺旋體、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）等。早期以酶免檢測（ELISA 技術）為主，但是靈敏度低。而以 PCR 技術為主的核酸檢測（NAT）具有更高的靈敏性和特異性，能顯著降低輸血感染病毒帶來的風險。

標準品在分子診斷中的應用

分子診斷的流程具有多個環節，從樣品樣本提取到變異檢測，每個環節都存在不確定因素和不可規避的系統誤差，這使得分析結果存在假陽性或假陰性的可能。因此需要標準品，來檢測與校對分析體系的準確性。

分子診斷標準品應該具備以下3個特征:

1.  代表性。標準品需要與待測樣品在基因遺傳背景、細胞類型、組織類型和處理方式等方面高度相似，才能模擬待測樣品的檢測過程，以分析實驗體系的精準度和判別待測樣品結果。

2. 可量化。標準品需要具備突變頻率階梯性，將編輯細胞與野生型細胞以不同比例混合，用于模擬不同疾病或檢測系統的檢測上下限。

3. 持續穩定。標準品需要能持續且穩定生產。

在PCR檢測變異的流程中，可以用標準品來驗證試劑盒的提取效率、變異檢測的準確度、試劑盒的靈敏度等。在核酸提取步驟中，樣本經過不同的處理往往對核酸提取率有影響，比如經過福爾馬林、石蠟包埋等處理等。如果存在與患者樣本處理方式、材質、細胞復雜性和結構特性相似的標準品，例如FFPE標準品，則可以在提取環節中得知提取效率。如果更換提取體系時，只要使用相同的標準品，還可以比較不同提取體系的提取效率。同理，標準品在文庫構建階段和測序階段也發揮著相同的作用，用于確定建庫效率和測序質量。

生信分析位點變異情況時，由于標準品的突變位點、突變基因型和突變頻率等信息都是通過人為修飾且已知，所以如果信息分析流程得出的變異檢測結果與此不符，就需要調整參數，以得到準確的分析體系，同時還能準確判斷患者樣品的實際變異情況。

點突變細胞在分子診斷中的應用

基因點突變通常指單個堿基的替換或插入缺失。隨著CRISPR-Cas9技術的發展與應用，不管是基于同源重組（HDR）或單堿基編輯系統的基因點突變修飾變得更加容易實現。全球有超過50000種人遺傳疾病，其中大部分是由基因組的點突變引起的。例如罕見病，點突變引起的占了50%。對于這些疾病的分子診斷就顯得更為重要。同樣的，這些基因點突變疾病的分子診斷也會面臨上述的問題：需確保分析體系的準確性。此時以點突變細胞作為分子檢測的標準品，便可以解決。

小結
隨著精準醫療的概念不斷深入人心，分子診斷越來越貼切我們的生活，同時由于技術的不斷發展，PCR、高通量測序等技術的靈敏度、精確性和成本都不斷再改善，促使分子診斷行業快速發展。但由于檢測系統存在不可消除的系統誤差或不確定因素，檢測結果可能出現假陽性或假陰性。那么設置分子診斷標準品，消除系統誤差則顯得十分重要。