1)擴增產物長度 100 bp-150 bp 為佳;
2)引物長度 17 bp-25 bp 最好;
3)正向引物和反向引物的 Tm 值最好相差不要超過 1℃。Tm 值調整至 60℃-65℃為佳;
4)引物的 GC 含量控制在 40%-60%之間,最佳為 45%-55%;
5)引物 3'末端堿基最好為 G 或 C 或 A,避免使用 T;
6)避開引物內部或者兩條引物之間有 3 個堿基以上的互補序列,二條引物之間的 3'端避開有 2 個堿基以上的互補序列;
7)引物 A、G、C、T 整體分布盡量要均勻,避免使用 GC 或者 TA 含量高的區(qū)域,尤其是 3'端,必須避開 GC 含量不均勻的區(qū)域;
8)最好跨內含子設計引物。
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