實(shí)時熒光定量PCR儀是一種高效的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)儀器，由熒光定量系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)組成，可以用于測定DNA或RNA的數(shù)量和序列，在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。與實(shí)時設(shè)備相連的計(jì)算機(jī)收集熒光數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)通過開發(fā)的實(shí)時分析軟件以圖表的形式顯示。原始數(shù)據(jù)被繪制成熒光強(qiáng)度相對于循環(huán)數(shù)的圖表。原始數(shù)據(jù)收集后可以開始分析。

下面介紹實(shí)時熒光定量PCR儀的操作步驟，為廣大用戶提供參考。

1. 準(zhǔn)備樣品

將需要進(jìn)行PCR擴(kuò)增的樣品進(jìn)行提取和準(zhǔn)備，如血液、組織、細(xì)胞、培養(yǎng)基等。對于DNA或RNA的純度和濃度要求較高，因此需要進(jìn)行質(zhì)控和標(biāo)準(zhǔn)化。

2. 制備PCR反應(yīng)體系

根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，制備PCR反應(yīng)體系，包括PCR試劑、引物、探針、樣品和反應(yīng)液的比例。反應(yīng)液一般包括PCR buffer、MgCl2、dNTPs、Taq DNA聚合酶和水。

3. 裝載樣品和反應(yīng)體系

將制備好的PCR反應(yīng)體系注入至PCR管中，對于多孔板，可以使用自動化的液體處理系統(tǒng)進(jìn)行裝載。將PCR管張貼在實(shí)時PCR儀的板上。

4. 設(shè)置PCR參數(shù)

在實(shí)時PCR儀中，設(shè)置PCR參數(shù)，包括反應(yīng)溫度、循環(huán)程序、擴(kuò)增效率、目標(biāo)長度等。此外，還需要設(shè)置測量周期、檢測通道等。

5. 進(jìn)行PCR擴(kuò)增

啟動實(shí)時PCR儀，進(jìn)行擴(kuò)增過程，從而監(jiān)測PCR反應(yīng)的進(jìn)展和結(jié)果。實(shí)時PCR儀會在反應(yīng)期間進(jìn)行熒光檢測和數(shù)據(jù)收集。

6. 數(shù)據(jù)分析

收集實(shí)時PCR儀得到的數(shù)據(jù)，利用相關(guān)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和結(jié)果解釋。可以通過熱圖、標(biāo)準(zhǔn)曲線、閾值計(jì)算等方式，評估PCR反應(yīng)的質(zhì)量和數(shù)量，從而對樣品進(jìn)行檢測和分析。