本生資訊：考馬斯藍染料原理、使用步驟匯總

　　考馬斯藍染料簡介：

　　考馬斯藍廣泛用于瓊脂糖或丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質的可視化。

　　考馬斯亮藍R250(紅色染成藍色)電泳(更靈敏：可以檢測到0.1微克蛋白質)，考馬斯藍G250(淺綠色藍色)用于溶液中的蛋白質分析(方便-可溶)。兩者都可以用于每種應用中，但是它們可以互換使用，因為它們可以將蛋白質染色成不同的強度和顏色。

　　考馬斯藍染料技術說明：

　　考馬斯藍R-250和G-250染料是考馬斯染料的兩種最常見的化學形式，是二磺化的三苯基甲/烷化合物。R-250(紅色)缺少以G-250(綠色)形式存在的兩個甲基。“250”最初表示染料的純度。

　　考馬斯藍染色原理：

　　不同的顏色是染料分子不同帶電狀態的結果。

　　當pH值小于0時，考馬斯藍G250染料會腐蝕所有帶正電荷的三個氮原子，顏色為紅色最大吸收波長為465nm。當pH值約為1時，染料的總電荷為+1(2-磺酸基團帶負電，因為它們的pKa極低)，所以染料是綠色的，具有吸收能力最大值為620nm，而pH值高于2時，染料為亮藍色，最大值為595nm。在pH值為7時,二苯/胺部分帶正電荷，總電荷為?1，染料消光系數為43 000 M?1厘米?1.

　　染料與蛋白質的氨基和羧基(非共價)靜電相互作用，因此主要來自堿性氨基酸(主要是精氨酸、賴氨酸、組氨酸)，以及疏水性氨基酸(苯丙氨酸，酪氨酸、色氨酸)。當在pH=3.0的0.01M檸檬酸鹽緩沖液中溶解時，考馬斯的最大吸收波長為555nm;蛋白質-染料復合物的特征是峰略寬于游離染料的峰，最大值為549nm。

　　考馬斯凝膠染色劑和布拉德福德蛋白質分析試劑是以25-50%甲醇中的極酸性溶液配制的。在酸性條件下，染料主要通過堿性氨基酸(主要是精氨酸、賴氨酸和組氨酸)與蛋白質結合，而絡合物的形成穩定了產生藍色的染料的負電荷陰離子形式。每個蛋白質分子結合的考馬斯染色配體的數量約為與蛋白質上發現的正電荷數成正比。蛋白質結合導致染料從紅棕色至亮藍色(最大吸收波長為595nm)。

　　考馬斯藍G-250染料的水溶性在膠體考馬斯染色方案中得到了很好的應用。

　　溶液中蛋白質測定-布拉德福德法

　　1. 著色溶液成分：5%考馬斯藍G250

　　2. 著色溶液制備：

　　a.將50mg考馬斯藍G250溶于50ml甲醇中

　　b.從步驟1開始向溶液中加入100ml 85%H3PO4

　　c.將步驟2的溶液加入500ml H2O中，混勻

　　d.過濾以去除任何沉淀物

　　e.再添加350ml H2O和miw 儲存于4°C。

　　3. 分析流程20-150 µg 蛋白; 200-1500 µg/mL

　　a. 準備0.15M NaCl溶液稀釋至最終濃度為250、，500、750和1500微克/毫升濃度。同時準備待測樣品稀釋液。

　　b. 向單獨的試管(或分光光度計試管)中添加100µL蛋白至以上濃度NaCl稀釋液中。

　　c. 再向每個試管中添加5.0mL考馬斯藍，通過渦流或倒置進行混合。

　　d. 將分光光度計調整到595nm的波長，并使用不含蛋白質的試管進行空白。

　　e. 等待5分鐘，在595nm波長下讀取每個標準和每個樣品。

　　f. 繪制標準溶液的吸光度與蛋白濃度的關系。計算消光系數并計算未知樣本的濃度。

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