一、肺癌類器官構建——Organotial人肺癌類器官培養基試劑盒（abs9443）

（1）取材后的組織須放在預冷的（2-8°C）組織保存液的取樣瓶中，快速轉運至潔凈實驗室進行組織處理和細胞分離，拍照并登記信息。

（2）準備若干培養皿，加入 4℃預冷的原代培養緩沖液備用。

（3）取樣瓶消毒，將組織放入培養皿中，利用原代培養緩沖液清洗三次后，去除雜質，利用眼科剪或手術刀將組織剪切成體積約為1-3mm³的組織塊。

（4）組織用人肺癌原代組織消化液消化，37℃震蕩消化10-20min（消化過程中隨時觀察消化情況）。

（5）取少量液體在顯微鏡下觀察，鏡下觀察到較多的單個細胞或70um以下的細胞簇后，加入三倍體積原代培養緩沖液終止消化。

（6）使用100um孔徑的篩網（abs7009）進行過濾，將濾液收集后，于300g富集離心5min后移去上清，添加原代培養緩沖液重新重懸離心。

（7）基質膠計算：第6步后觀察收集到的組織體積，添加25倍組織體積的基質膠（abs9495）重懸鋪板。

（8）24孔細胞培養板為例，每孔點膠25ul組織基質膠混合物進行鋪板（4℃下操作）。

（9）將鋪好的培養板放入37℃培養箱中10-15min成膠，添加人肺癌類器官培養基（恢復室溫）進行培養。

二、多重熒光免疫組化鑒定——六色多重熒光免疫組化染色試劑盒（abs50014）

（1）樣本制備：類器官樣本制備，參考類器官實操大本營之——固定包埋
（2）烤片：60℃烤片30min。
（3）脫蠟、水化：二甲苯（5min）——二甲苯（5min）——二甲苯（5min）——100%乙醇（5min）——100%乙醇（5min）——95%乙醇（3min）——85%乙醇（3min）——75%乙醇（3min）——去離子水（5min)。
（4）抗原修復：取200ml抗原修復液，加入染色盒中，將組織切片置于染色盒內耐高溫塑料切片架上，置于高壓鍋內加熱至飽壓，然后繼續加熱5min，關閉電源，10min后取出染色盒，室溫冷卻30min，畫上阻水圈，置入PBST浸洗3次，每次3min。
（5）阻斷內源性過氧化物酶：每切片加100μL3% H₂O₂，室溫下孵育10min，PBST浸洗3min×3次。
（6）封閉：除去PBST液，每張切片加100μL 5% 山羊血清封閉液，室溫孵育30min，除去封閉液。
（7）一抗孵育：每張切片加100μL一抗工作液，室溫保濕孵育1h，PBST浸洗3min×3次。
（8）二抗孵育：除去PBST，每張切片加100μL二抗，室溫保濕孵育15min，PBST浸洗3次，每次3min。
（9）染料孵育：除去PBST，每張切片加100μL現配的1*染料工作液（使用信號放大液按1:100稀釋），孵育10min后，置入PBST內洗滌，室溫浸片洗滌3次，每次3min。
（10）抗體洗脫：抗體洗脫液（abs994）37℃ 預熱，滴加少量抗體洗脫液覆蓋樣本，室溫放置3~5min；棄去洗脫液，再次滴加足量的洗脫液覆蓋樣本，37°C 孵育20min；PBST浸洗3次，每次3min。
（11）重復步驟（6）-（10），直至所有目標抗體染色完成。
（12）核染：滴加1*DAPI工作液到樣品上，浸沒樣本區域，室溫孵育10min后，用1*PBST浸洗玻片3次，每次2min。
（13）封片：滴加抗熒光淬滅封片劑，用蓋玻片封片，避免氣泡。
（14）掃描成像，數據分析。

Absin肺癌類器官多色風采展

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