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Western Blot中的內(nèi)參設(shè)定
Western Blot（WB）是檢測(cè)一個(gè)基因表達(dá)是否正確及表達(dá)量多少的方法。WB操作簡(jiǎn)單，既可以定性分析表達(dá)產(chǎn)物，同時(shí)還可以指示目的蛋白量的相對(duì)變化。作為一種有活性的生物大分子，抗體和抗原的反應(yīng)是比較復(fù)雜的，因此用來(lái)測(cè)定表達(dá)產(chǎn)物時(shí)存在著一定的不確定性。所以，在WB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中加入良好的參照體系，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析是非常有幫助的。 參照體系通常包括分子量Marker（用來(lái)確定蛋白條帶對(duì)應(yīng)的分子量大小），空白載體對(duì)照（如果是誘導(dǎo)表達(dá)體系還應(yīng)該有誘導(dǎo)前的對(duì)照），已知量標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)物的正對(duì)照，此外還有內(nèi)參。
內(nèi)參是zui容易被忽略的一項(xiàng)，如果要用WB比較不同條件下或者不同組織中，目的蛋白表達(dá)量的相對(duì)多少，等量的細(xì)胞上樣才有比較的基礎(chǔ)。特別表達(dá)量不高時(shí)，上樣量的差別就很可能影響結(jié)果的分析，所以此時(shí)內(nèi)參就顯得尤為重要。
內(nèi)參即是內(nèi)部參照（Internal Control），對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)來(lái)說(shuō)一般是指由管家基因編碼表達(dá)的蛋白（Housekeeping Proteins），它們?cè)诟鹘M織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定，在檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平變化時(shí)常用它來(lái)做參照物。在WB實(shí)驗(yàn)中，除了需要進(jìn)行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上樣電泳、轉(zhuǎn)膜、靶蛋白抗體孵育、顯色等步驟以外，還需要進(jìn)行內(nèi)參的檢測(cè)，以校正蛋白質(zhì)定量、上樣過(guò)程中存在的實(shí)驗(yàn)誤差，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
蛋白濃度測(cè)定是比較各種樣品間上樣量的*方法。然而各種蛋白質(zhì)濃度定量方法都存在局限性，不能*準(zhǔn)確的確定各種樣品的準(zhǔn)確蛋白濃度。如UV法直接定量，適合測(cè)試較純凈、成分相對(duì)單一的蛋白質(zhì)，相對(duì)于比色法來(lái)說(shuō)，操作簡(jiǎn)單，但是容易受到平行物質(zhì)的干擾，如DNA的干擾；且敏感度低，要求蛋白的濃度較高。比色法測(cè)定蛋白濃度一般有BCA，Bradford，Lowry 等幾種方法。BCA法與Lowry法都容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。Bradford 法敏感度zui高，且與一系列干擾Lowry，BCA 反應(yīng)的還原劑（如DTT，巰基乙醇）相容。但是對(duì)于去污劑依然是敏感的，其zui主要的缺點(diǎn)是不同的標(biāo)準(zhǔn)品會(huì)導(dǎo)致同一樣品的結(jié)果差異較大，無(wú)可比性。另外，蛋白質(zhì)定量以后進(jìn)行電泳時(shí)需要等量上樣，此步驟也存在操作誤差。在WB實(shí)驗(yàn)時(shí)使用內(nèi)參，即可簡(jiǎn)便地對(duì)定量和上樣步驟產(chǎn)生的誤差進(jìn)行校正。
在WB中使用內(nèi)參其實(shí)就是在WB過(guò)程中的另外用內(nèi)參對(duì)應(yīng)的抗體檢測(cè)內(nèi)參，這樣在檢測(cè)目的產(chǎn)物的同時(shí)可以檢測(cè)內(nèi)參的表達(dá)，由于內(nèi)參在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定，借助檢測(cè)每個(gè)樣品內(nèi)參的量就可以用于校正上樣誤差，這樣半定量的結(jié)果才更為可信。此外使用內(nèi)參可以作為空白對(duì)照，檢測(cè)蛋白轉(zhuǎn)膜情況是否*、整個(gè)WB顯色或者發(fā)光體系是否正常。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析其實(shí)很簡(jiǎn)單：如果樣品蛋白量有限，只夠進(jìn)行一次電泳轉(zhuǎn)膜實(shí)驗(yàn)時(shí)，分別檢測(cè)樣品的內(nèi)參量和目的蛋白量。將各樣品目的蛋白量分別除以其內(nèi)參含量，得到的數(shù)值即為內(nèi)參校正后的各樣品中目的蛋白相對(duì)含量，再用此數(shù)值進(jìn)行樣品間的比較和分析，得到目的蛋白含量在不同樣品間的實(shí)際變化結(jié)果。如果樣品量充分，可以先檢測(cè)內(nèi)參，觀測(cè)樣品間內(nèi)參顯色條帶是否一致，根據(jù)差異大小調(diào)整各樣品的上樣量重新進(jìn)行Western Blotting實(shí)驗(yàn)，至內(nèi)參量一致為止；若內(nèi)參一致，即可進(jìn)行不同樣品間目的蛋白表達(dá)變化分析。常用的蛋白質(zhì)內(nèi)參有GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）和細(xì)胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。
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