ELISA試劑盒實驗加入顯色底物后，標準品有顏色，但結果分析發現標準品點吸光值偏低或偏高、標準曲線無梯度等等，總結如下原因：

一、標準曲線點吸光值偏高，超出儀器檢測范圍

ELISA標準曲線點的吸光值一般在3.0以下，若太高超出儀器檢測范圍，顯示OVER FLOW，可能原因：

1.如OD絕對值靠譜，則顯色過度TMB顯色體系中建議根據S1，S2顏色進行判斷， 當S1，S2深藍色，有明顯梯度，S5有淡藍色時即可終止。

2.僅作單波長檢測由于參考波長讀取非特異性檢測，如指紋、劃痕、水漬等， 對結果也有影響。建議終結果以雙波長為準確。

二、標準曲線點吸光值偏低

ELISA標準曲線點的吸光值一般要在0.8以上，若小于0.8，可能的原因：

1.粉末標準品未充分溶解粉末標準品按說明書加一定體積的液體后，輕柔混勻， 室溫靜置30分鐘，充分溶解。

3.標準品反復凍融標準品反復凍融后活性降低。

4.孵育溫度、時間按說明書要求孵育條件進行孵育。

4.顯色時間控制TMB顯色體系中建議根據S1，S2顏色進行判斷，當S1，S2深藍色，有明顯梯度，S5有淡藍色時即可終止。

三、標準曲線無梯度

ELISA 實驗中標準品2倍倍比稀釋，但結果分析標準曲線沒有梯度，可能的原因：

1.樣品或標準品污染避免污染

5.錯誤的樣品或標準品的稀釋按照說明書稀釋

6.偶聯抗體濃度過高按照說明書調整到佳的濃度

4.TMB底物孵育時間過長調整到合適的孵育時間

5.錯誤的孵育時間或溫度按照說明書

6.孵育時未加蓋導致溶液揮發和污染貼封片或加蓋

總結

得到ELISA試劑盒標準曲線，需要注意幾點：

1、 充分溶解標準品；

2、 標準品避免反復凍融；

3、 梯度稀釋標準品注意混勻。