競爭法ELISA(也稱抑制或封閉法ELISA)通過定量某種樣品分析物對預計信號的干擾，來測定該分析物在樣品中的含量，可通過以下方式進行：微孔板用一種分析物或一種對靶標分析物具有特異性的抗體包被(即直接法和間接法)，再添加一種有部分某種檢測的靶標分析物，以競爭結合抗體上的位點。信號與分析物含量呈負相關，因此，如果靶標分析物的濃度較分析物高，靶標分析物競爭性結合有標記抗體，參考信號將會較靶標分析物的濃度較低的情況增強。

競爭法的理論基礎是抗體，只有在抗體基礎上，兩種抗原才會形成競爭關系。該方法一般用來檢測具有較少表位的小分子物質

實驗概要

以直接競爭法ELISA試劑盒為例，將特異性抗體吸附于固相載體，加入待測抗原(標準品或樣本)和生物素標記的檢測抗原，二者競爭與固相抗體結合，然后加入辣根過氧化物酶標記的親和素，經過溫育和洗滌后加入顯色底物。顯色的深淺與樣品中待測物質含量呈負相關。準備所有的試劑和梯度稀釋的標準品。板條加入洗液靜置浸泡30 秒。標準品孔加入2倍倍比稀釋的標準品；非特異性結合(NSB)和大結合(B0)孔加入標準品稀釋液或培養基。血清/血漿：樣本孔加入樣本；細胞培養上清：樣本孔加入細胞培養上清。除了Blank和非特異性結合(TA)孔空白，NSB孔加入1×檢測緩沖液，其余每孔加入稀釋的偶聯物。封膜，室溫孵育1小時，洗滌6次。除了TA和Blank孔，其余每孔加入稀釋的HRP標記的鏈霉親和素,封膜，室溫孵育30分鐘，洗滌6次。TA孔加入稀釋的HRP標記的鏈霉親和素。每孔加入顯色底物，避光，室溫孵育5 - 30分鐘每孔加入終止液,30分鐘內，在450nm波長檢測OD值，參考波長570nm或630nm。

注：以上步驟是以研域生物ELISA試劑盒為參考，不同廠家的試劑盒操作步驟可能不一樣，開始實驗前一定要仔細閱讀產品說明書哦~直接競爭法和間接競爭法的區別直接競爭法：標記抗原，與檢測樣品中的抗原競爭抗體；間接競爭法：標記抗體，固相抗原與檢測樣品中的抗原競爭標記抗體。

模型

直接競爭法：包被抗體，用HRP-抗原與樣本一起加入。樣本中的Ag與HRP-Ag競爭Solid-Ab，固相吸附的HRP-Ag與樣本中的Ag濃度成反比；間接競爭法的模型：包被抗原，用HRP-抗體與樣本一起加入。樣本中的Ag與Solid-Ag競爭HRP-Ab，固相吸附的HRP-Ab與樣本中的Ag濃度成反比。

結合機會

直接競爭法：標記抗原與待測抗原均是液相，與抗體的結合機會是一樣的；間接競爭法：固相抗原與抗體的接觸面積較小，固相抗原與待測抗原的結合抗體機會是不平等的，接近順序飽和法，即只有與待測抗原結合剩余的抗體才會與固相抗原結合。直接競爭法：一般難以進行放大，常用的有生物素化抗原與酶標親和素；間接競爭法：一般可以使用酶標二抗。

間接競爭法靈敏度大于直接競爭法。

由于結合機會的差異，間接法的抑制率大于直接法，從而抑制曲線斜率會大于競爭法，故靈敏度越大。在進行系統放大時，間接法一般可以使用酶標二抗，進一步提高靈敏度。競爭法ELISA試劑盒也可以用來檢測大分子抗原甚至是抗體。檢測大分子抗原時，由于空間位阻的影響，使得該檢測方法沒有雙抗體夾心法靈敏度高。檢測抗體時，由于兩種競爭的抗體來源不一，兩種抗體趨同性不高，導致檢測結果的可信性不高。