實驗原理：  

重組子的建立：采用雙酶切 質粒 載體pBR322和pUC18,酶切后產生了互補的粘性末端,在T4 DNA 連接酶的作用下,兩個質粒片段連接.

感受態細胞(Competent cells)：受體細胞經過一些特殊方法(如：CaCl,RuCl等化學試劑法)的處理后, 細胞膜 的通透性發生變化,成為能容許多有外源DNA的載體分子通過的感受態細胞(competent cell) .

轉化(transformation)：是將異源DNA分子引入一 細胞株 系,使受體細胞獲得新的遺傳性狀的一種手段,是基因工程等研究領域的基本實驗技術.

電轉化法：使用低鹽緩沖液或水洗制備的感受態細胞,通過高壓脈沖的作用將載體DNA分子導入受體細胞.

克隆的篩選：主要用不同 抗生素 基因篩選.常用的 抗生素 有：氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、四環素、鏈霉素等；

重組質粒克隆的鑒定：鑒定帶有重組質粒克隆的方法常用的有α-互補、小規模制備質粒DNA進行酶切分析、插入失活、PCR以及雜交篩選的方法.

方法是小規模制備質粒DNA進行酶切分析,對于帶有LacZ基因的載體還可以結合α-互補現象來篩選.

操作方法：  

1、構建重組質粒

質粒pUC18和pBR322分別用Pst I和EcoR I雙酶切,將酶切產物按照1：1的比例混合,使用T4 DNA連接酶連接,構建成重組質粒.

2、制備感受態大腸桿菌細胞

收集大腸桿菌細胞,采用CaCl2處理,制備成 感受態細胞 .

3、重組子的轉化

將構建的重組質粒加入到制備的感受態細胞懸浮液中,電擊法將重組質粒轉化到宿主細胞中.

4、重組子的篩選鑒定

采用藍白篩選重組子.酚/氯/仿快速抽提質粒,酶切后 電泳 鑒定.


步驟與注意事項：

1、連接反應溫度選擇要適中,過高粘末端之間形成氫鍵不穩定,過低會影響 連接酶 的活性.

2、連接反應兩種質粒的比例為1：1,否則容易自連.

3、制備感受態細胞時要采用對數生長期初期的細胞,低溫處理時間要足夠.

4、電擊法時電擊電壓、電流、時間選擇要合適.

5、轉化及藍白篩選要作陰、陽性對照,防止出現假陽性、假陰性.