蛋白質的沉淀方法及常見沉淀劑

蛋白質沉淀的概念：www.runwelltac.com
蛋白質分子凝聚從溶液中析出的現象稱為蛋白質沉淀（precipitation），變性蛋白質一般易于沉淀，但也可不變性而使蛋白質沉淀，在一定條件下，變性的蛋白質也可不發生沉淀。

定性分析：
蛋白質所形成的親水膠體顆粒具有兩種穩定因素，即顆粒表面的水化層和電荷。若無外加條件，不致互相凝集。然而除掉這兩個穩定因素（如調節溶液pH至等電點和加入脫水劑）蛋白質便容易凝集析出。如將蛋白質溶液pH調節到等電點，蛋白質分子呈等電狀態，雖然分子間同性電荷相互排斥作用消失了。但是還有水化膜起保護作用，一般不致于發生凝聚作用，如果這時再加入某種脫水劑，除去蛋白質分子的水化膜，則蛋白質分子就會互相凝聚而析出沉淀；反之，若先使蛋白質脫水，然后再調節pH到等電點，也同樣可使蛋白質沉淀析出。

沉淀方法：
1.鹽析法——多用于各種蛋白質和酶的分離純化

在蛋白質溶液中加入大量的中性鹽以破壞蛋白質的膠體穩定性而使其析出，這種方法稱為鹽析。常用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等。各種蛋白質鹽析時所需的鹽濃度及pH不同，故可用于對混和蛋白質組分的分離。例如用半飽和的硫酸銨來沉淀出血清中的球蛋白，飽和硫酸銨可以使血清中的白蛋白、球蛋白都沉淀出來，鹽析沉淀的蛋白質，經透析除鹽，仍保證蛋白質的活性。調節蛋白質溶液的pH至等電點后，再用鹽析法則蛋白質沉淀的效果更好。鹽析法分為兩類，*類叫Ks分段鹽析法，在一定PH和溫度下通過改變離子強度實現，用于早期的粗提液；第二種叫b分段鹽析法，在一定離子強度下通過改變PH和溫度來實現，用于后期進一步分離純化和結晶。影響鹽析的因素包括：蛋白質濃度、離子強度和類型、PH值、溫度等。針對溫度這一條，需要強調：在低離子強度或純水中，蛋白質溶解度在一定范圍內隨溫度增加而增加。但在高濃度下，蛋白質、酶和多肽類物質的溶解度隨溫度上升而下降。在一般情況下，蛋白質對鹽析溫度無特殊要求，可在室溫下進行，只有某些對溫度比較敏感的酶要求在0-4℃進行。
使用硫酸銨沉淀蛋白需要注意：硫酸銨中常含有少量的重金屬離子，對蛋白質巰基有敏感作用，使用前必須用H2S處理：將硫酸銨配成濃溶液，通入H2S飽和，放置過夜，用濾紙除去重金屬離子，濃縮結晶，100℃烘干后使用。另外，高濃度的硫酸銨溶液一般呈酸性（PH=5.0左右），使用前也需要用氨水或硫酸調節至所需PH。

2.有機溶劑沉淀法——多用于生物小分子、多糖及核酸產品的分離純化；

有機溶劑的沉淀機理是降低水的介電常數，導致具有表面水層的生物大分子脫水，相互聚集，zui后析出。該法優點在于：1）分辨能力比鹽析法高，即蛋白質或其它溶劑只在一個比較窄的有機溶劑濃度下沉淀；2）沉淀不用脫鹽，過濾較為容易；3）在生化制備中應用比鹽析法廣泛。但是，在常溫下，有機溶劑沉淀蛋白質往往引起變性。例如酒精消毒滅菌就是如此。因此，操作要求在低溫下進行。有機溶劑的選擇首先是能和水混溶，使用較多的有機溶劑是乙醇、甲醇、丙酮，還有二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、乙腈和2-甲基-2,4戊二醇等。

3.等電點沉淀法——此法單獨應用較少，多與其它方法結合使用；

兩性電解質分子上的凈電荷為零時溶解度zui低，不同的兩性電解質具有不同的等電點，以此為基礎可進行分離。如工業上生產胰島素時，在粗提液中先調PH8.0去除堿性蛋白質，再調PH3.0去除酸性蛋白質。利用等電點除雜蛋白時必須了解制備物對酸堿的穩定性，不然盲目使用十分危險。不少蛋白質與金屬離子結合后，等電點會發生偏移，故溶液中含有金屬離子時，必須注意調整PH值。等電點法常與鹽析法、有機溶劑沉淀法或其他沉淀方法聯合使用，以提高其沉淀能力。
 

附：沉淀血漿中各種溶劑以及去蛋白的效果<各種蛋白沉淀劑作用的比較>