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原代細胞具有貼壁特殊性，因此在消化后轉移至其他實驗器皿（如玻璃爬片、培養板、共聚焦培養皿等）時，常出現貼壁不牢的情況，因此我們需要對實驗器皿進行包被處理，以增強細胞的貼壁性。
本期細胞學堂將為您詳述原代細胞培養中的包被操作步驟及注意事項，讓您的實驗順暢無阻！
為了適應不同實驗需求，需要對培養器皿用不同的物質包被后使用，包被條件常選用膠原蛋白Ⅰ（12μg/mL）、多聚賴氨酸PLL（0.1mg/mL）和明膠（0.1%）三種，依據細胞種類而定。
NO、1
膠原蛋白Ⅰ
膠原蛋白Ⅰ是最常見的膠原蛋白，能促進細胞的貼壁和增殖，常用于上皮細胞、肝細胞、肌細胞等原代細胞的培養；
NO.2
多聚賴氨酸PLL
多聚賴氨酸是一種合成化合物，是帶正電荷的氨基酸，通過改變培育基質外表的電極來促進細胞貼壁，其包被的培養板適用于神經元細胞、神經膠質細胞及轉染細胞系的培養；
NO.3
明膠
明膠來自于膠原的高分子量水溶蛋白混合物，0.1％的明膠溶液常用于包被培養器皿以促進細胞貼壁。明膠包被板常用于培養正常或轉染細胞如血管內皮細胞、心肌細胞、胚胎干細胞、胰島細胞等。
1
準備器皿
取出無菌培養器皿，如T25培養瓶（以下以T25瓶為例）；
2
加包被試劑
取出包被試劑，在超凈工作臺內用移液器吸取1-2mL，加入T25瓶內，輕輕晃動瓶身，確保底部全部覆蓋液體（注：使用的包被試劑為膠原蛋白Ⅰ或明膠時，1瓶可一次性加入5mL，同時包被5瓶，用5mL潤洗每瓶瓶底部后，每瓶均分1mL進行后續包被操作)；
3
放入培養箱
將培養瓶蓋好，放入37℃培養箱。PLL包被需要靜置30-60min以上，膠原蛋白Ⅰ包被和明膠包被需要靜置1-2h以上；
4
吸取包被試劑
取出培養瓶，吸出多余包被試劑（可留取下次使用，建議PLL試劑重復使用不超過2-3次，膠原蛋白Ⅰ和明膠重復使用不超過1次，多次使用會增加污染概率，減弱包被效果）；
5
靜置
將培養瓶蓋好，放入37℃培養箱（也可放4℃冰箱，保持無菌即可），靜置4-24h以上，確保培養瓶底部干燥、無液體。包被完畢，培養瓶一般可存放3-7天（常溫或4℃），建議3天內使用，存放過久，包被效果可能失效；
6
清洗
取出包被好的培養瓶，在超凈工作臺內，用PBS或培養基清洗。PLL包被的培養瓶需清洗2-3次，膠原蛋白Ⅰ和明膠包被培養瓶則清洗1-2次即可；
7
包被完成
正常接種使用培養瓶。
01
包被試劑的保存：無菌多聚賴氨酸PLL（0.1mg/mL）需要4℃下保存，可保存三個月；無菌膠原蛋白Ⅰ（12μg/mL）和無菌明膠（0.1%）需要在4℃下保存，1-2周內使用，蛋白制品放置過久易失效；
02
選擇包被液用量依據不同培養器皿而定，一般確保培養器皿底部完-全覆蓋為準（并且確保包被時間內不干）；
培養器皿 | 用量推薦（僅供參考） |
12孔板/孔 | 0.5mL |
6孔板/孔 | 0.8mL |
6cm培養皿/皿 | 1-1.5mL |
10cm培養皿/皿 | 3mL |
T25瓶/瓶 | 1-1.5mL |
T75瓶/瓶 | 3-4mL |
03
PLL有輕微毒性，膠原蛋白Ⅰ、明膠配置溶劑部分有少量毒性，所以包被后的培養器皿，使用前必須用PBS或培養基清洗1-3次；
04
細胞爬片等玻璃制品因材質問題，本身吸附能力弱，一般必須包被；
05
包被分為包被時間和干燥時間，包被時間是包被液吸附作用時間，一般按推薦時間即可。干燥時間是包被后培養器皿晾干時間，是為了確保包被液晾干，達到更好的粘性吸附效果；
06
以上所有操作均以無菌試劑、耗材，無菌環境內操作為前提。
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