圖1 .3種測(cè)序方法簡(jiǎn)單對(duì)比

靶向捕獲包含雜交捕獲、多重PCR和分子倒置探針捕獲。和PCR以及分子倒置探針捕獲（MIP）方法相比，雜交捕獲具有捕獲區(qū)段大（可達(dá)幾百M(fèi)B）和探針均一性好的優(yōu)勢(shì)。

均一性是評(píng)價(jià)捕獲技術(shù)很關(guān)鍵的參數(shù)，均一性好后續(xù)測(cè)序成本就會(huì)下降。缺點(diǎn)是容易捕獲非目標(biāo)片段，造成成本增加。因?yàn)殡s交前樣本會(huì)被隨機(jī)打斷到比較合適的長(zhǎng)度，探針捕獲時(shí)可能和目標(biāo)片段部分雜交，導(dǎo)致一些含有部分目標(biāo)區(qū)段的文庫被捕獲。所以雜交捕獲的特異性較差，容易捕獲非目標(biāo)區(qū)段。

圖2.靶向捕獲技術(shù)優(yōu)劣勢(shì)對(duì)比圖

根據(jù)探針的狀態(tài)和雜交狀況不同雜交捕獲分為固態(tài)雜交和液態(tài)雜交。固相雜交捕獲法是先選定目標(biāo)DNA區(qū)域，在芯片上修飾與目標(biāo)區(qū)域互補(bǔ)的探針，隨后在芯片上進(jìn)行DNA與探針的雜交反應(yīng)，最后將與探針雜交的DNA洗脫下來用于后續(xù)的測(cè)序工作。液相雜交捕獲技術(shù)是根據(jù)核酸分子堿基互補(bǔ)配對(duì)原理，在溶液中生物素標(biāo)記的探針與靶區(qū)域特異性結(jié)合，通過鏈霉親和素磁珠對(duì)探針捕獲到的目的片段進(jìn)行富集的技術(shù)。

固相雜交由于其在花費(fèi)與操作上的劣勢(shì)，已基本被淘汰，液相雜交捕獲法是目前被廣泛應(yīng)用的靶向測(cè)序方法，具有探針設(shè)計(jì)難度低、探針容錯(cuò)性高等優(yōu)點(diǎn)。

圖3 .固（左）/液（右）相雜交捕獲原理圖

在液相捕獲過程中，還有2個(gè)的角色接頭序列封阻劑（Universal Blocker）和重復(fù)序列封阻劑（Cot-1 DNA）。其中，Universal Blocker含有修飾堿基，可針對(duì)不同的index序列進(jìn)行封閉；Cot-1 DNA來源于人胎盤中提取的基因組DNA，為人基因組中長(zhǎng)約50至300 bp的高度重復(fù)序列，能夠方便、有效地對(duì)待檢測(cè)樣品核酸序列中的重復(fù)序列進(jìn)行封閉，屏蔽重復(fù)序列，從而避免核酸雜交過程中非特異性信號(hào)的干擾。兩種封阻劑共同作用，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)待檢測(cè)核酸樣本中核酸序列的有效捕獲。

圖4.2種封閉試劑的作用原理

Cot-1最早是在核酸雜交實(shí)驗(yàn)中，用來避免探針的非特異性結(jié)合所導(dǎo)致的背景噪音。具體到液相雜交捕獲實(shí)驗(yàn)中，探針雖然是人為設(shè)計(jì)的序列，可以避免探針和高拷貝/重復(fù)性序列的結(jié)合，但當(dāng)Cot-1不足時(shí)，探針和文庫還是會(huì)產(chǎn)生一定數(shù)量的氫鍵而實(shí)現(xiàn)非特異性地結(jié)合，即使這種結(jié)合并不非常充分，或者只有部分區(qū)域的結(jié)合，但這種結(jié)合會(huì)導(dǎo)致捕獲特異性顯著下降。

Universal Blocker的作用相對(duì)明確，就是阻止不同文庫分子通過adapter之間的互補(bǔ)序列產(chǎn)生結(jié)合。

圖5.Cot-1和Blocker不足時(shí)非特異結(jié)合示意圖

翌圣全外顯子捕獲產(chǎn)品，包含全外探針、雜交清洗試劑盒、Blocking Oligo、Post-PCR Primer和鏈霉親和素磁珠，在遺傳突變檢測(cè)、腫瘤篩查等領(lǐng)域為您提供目標(biāo)區(qū)域更加明確，覆蓋度更深、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性更高，也更加經(jīng)濟(jì)的全套捕獲解決方案！