簡介

凋亡是一種重要的機制，可向胚胎發育等正常過程以及癌癥和神經退行性疾病等疾病過程中的細胞發出程序性死亡的信號。

EarlyTox Caspase-3/7 NucView 488 檢測試劑盒可通過使用 NucView 488 Caspase-3 底物檢測完整細胞群內的凋亡。該底物由熒光 DNA 染料偶聯 caspase-3/7 DEVD 識別序列組成。最初是非熒光的，它會滲透細胞膜。如果細胞是凋亡的，底物會被 caspase-3/7 裂解，釋放出進入細胞核并與 DNA 結合的染料，從而產生亮綠色熒光。細胞可以活細胞成像，無需洗滌步驟即可去除死細胞或凋亡細胞，但染料在固定后也會被保留。

這種靈活的檢測可使用 ImageXpress® Micro 高內涵成像系統和 MetaXpress® 分析軟件進行，以計算孔中凋亡細胞的發生率。

材料

• EarlyTox Caspase-3/7-D NucView 488 檢測試劑盒（Explorer Kit Cat. No. R8350 or Bulk Kit Cat. No. R8351, DMSO formulation）

• CHO M1WT3 細胞

• Camptothecin喜樹堿

• 384 孔黑色透明底微孔板 （Corning Falcon）

• DRAQ5 核染色

• ImageXpress Micro 高內涵成像系統

檢測方法

CHO 細胞以每孔 3，500 個細胞、每孔 50 μL 的密度接種于經 384 孔組織培養處理的微孔板中。允許它們在37°C、5% CO2的培養箱中附著并生長過夜。然后，將孔用從 100 μM 至 0.1 μM 的 1：2 梯度稀釋的喜樹堿（抗癌藥物）處理 24 小時，誘導凋亡。

在溫暖的培養基中制備了 10 μM 2X NucView 488 底物工作溶液。從每個孔中小心抽吸 25 μL，并替換為 25 μL 2X 底物溶液，最終濃度為 5 μM。將細胞在 37°C 下孵育 1 小時，之后以 10 μL 的量向每個孔中加入 6X DRAQ5 核染料溶液，最終濃度為 2 μM。孵育 30 分鐘后，使用 FITC 和 Cy5 濾光片組以及 10X Plan Apo 物鏡在 ImageXpress Micro 系統上讀取孔板（圖 1）。在此放大倍數下，一個視野通常捕獲 1，1001，400 個細胞核，以便一個圖像產生統計學相關結果。

圖 1：NucView Caspase 3/7 染色細胞（綠色）和 DRAQ5 核染色（紅色）的圖像疊加。（頂部）經 50 μM 喜樹堿處理的細胞表現出高凋亡細胞核發生率。（底部）未經處理的對照組顯示很少有細胞核具有凋亡染色。

兼容此 Molecular Devices 系統

ImageXpress Micro 高內涵
成像系統

數據分析

將在 ImageXpress Micro 成像系統上拍攝的細胞，使用細胞分類模塊在 MetaXpress 軟件中進行分析。通過直觀的用戶輸入，該模塊可識別 DRAQ5 染色細胞核作為總細胞計數，并將Caspase 3/7 陽性細胞核分類為凋亡細胞核。可評估如核大小、強度和凋亡百分比等多個參數。如果對化合物暴露產生的總毒性干擾凋亡評估，則分析中可省略細胞計數低于特定數量的孔。

結果

繪制凋亡細胞百分比與喜樹堿濃度的關系圖并應用 4 參數曲線擬合，得到 EC5₀ 值為 5.7μM 的濃度反應曲線（圖 2）。EarlyTox Caspase-3/7 NucView 488 檢測試劑盒與 ImageXpress Micro 系統和 MetaXpress 軟件配合使用，可為科學家提供快速、可靠的基于圖像的細胞凋亡定量。