定向進化主要包括文庫構建與突變體篩選兩部分，關鍵點則在于建立基因型和表型（即突變體性能）之間的物理對應關系。前兩期，我們已經介紹了酶定向進化的突變體文庫構建技術和突變體篩選技術，今天小翌來介紹基因型與表型的關聯。高效篩選方法的前提在于建立可靠的基因型和表型的關聯，這涉及兩個層面：首先符合預期表型的突變體的基因型可被回溯，即建立氨基酸序列和基因信息之間的聯系；其次，突變體相比于親本的表型變化能被設備或肉眼捕捉，最好能夠量化展示突變體性能提升的程度。
突變體的遺傳物質和蛋白存在物理聯系的關鍵在于將二者鎖定在固定的空間內，酶反應引起的物化性質變化作為篩選的依據，同一空間內的遺傳物質則作為突變體酶的分子標簽。體內篩選所用的微生物細胞是天然存在的的物理空間，符合期望的表型能直接回溯到相應基因型，并直接獲得可持續繁殖的個體。CSR、FADS技術中的微液滴則是在細胞外再構造了一層物理屏障，確保細胞破碎后其DNA和蛋白依然共存。而對于以無細胞反應系統為基礎的液滴篩選技術（圖1），缺少了微生物這個“內包裝”，均相溶液中核酸（mRNA或DNA）和蛋白則只能依賴分子間的相互作用而直接偶聯（如依賴嘌呤霉素和嘌呤霉素連接子建立聯系），形成類似mRNA-核糖體-蛋白三元復合物的結構，確保酶和相應的核酸一一對應。
另一類方式則是將突變體單克隆預先備份，突變體酶性能評價結束后通過試管編號回溯到相應的種子液，進行再培養和后續測試。而在液滴技術領域，隨著設備準確度、速度、智能化程度的提升，液滴編碼標記和單液滴分離技術也將可以實現FADS系統中的液滴的備份。
圖1. 酶反應過程監測
（圖片來自：doi: 10.1016/j.tibtech.2020.01.001）
高效檢測讓篩選事半功倍！
酶的種類千差萬別，不同酶又有多樣化的性能提升需求，因此定向進化篩選的標準是需要精確、客觀、容易量化的，最重要的是性能變化能直接或間接地被鑒別。
在體內篩選系統中，參與轉錄和翻譯過程的酶蛋白的性能變化能夠轉化為報告基因的水平差異，如涉及轉錄的甲基化酶、RNA聚合酶、轉錄因子（圖1c1）、調控因子，涉及翻譯的核酶、tRNA及tRNA合成酶。此外，一些轉錄因子需要與特定的代謝中間產物協同作用（如LacZ和半乳糖、AraC和阿拉伯糖），這些小分子涉及的代謝途徑相關酶，也有潛力在報告基因的基礎上建立胞內篩選體系。核糖開關是一段特殊的RNA序列，可在小分子的誘導下發生二級結構的改變，這類小分子同樣可以關聯到特定的代謝途徑，以核糖開關下游的報告基因的表達情況指示途徑中酶的性能變化（圖1c3、圖1c4）。
產物是最佳的酶反應標志物，在體外篩選體系中，產物可直接用質譜設備進行定量（圖1e），或監測產物積累引起的反應液濁度、pH、電勢、熒光強度的變化（圖1a&d）。然而，在高通量篩選時體系內的信號常會受到細胞碎片和內容物的干擾，微液滴內極低的產物總量也會對設備的靈敏度帶來較大考驗。因此，一些特異性識別、標記技術和級聯放大策略被用于輔助突變體的篩選。適配體是一段核酸序列（DNA或RNA），折疊為特殊的二級結構即可特異性識別并結合目標分子，甚至通過形成穩定的復合物而激發熒光（圖1c5），特征性地被設備識別進而提高檢測的特異性和靈敏度。適配體也可以作為RNA聚合酶的反應物，直接指示突變體的活性（圖2）。應用于DNA產物檢測的標記基團則可通過多種組合方式測試聚合酶、連接酶、限制性內切酶的活性，底物結構或完整度的變化而引起的熒光基團和淬滅基團空間距離的變化，讓熒光基團有潛力發出熒光而被設備捕獲（圖3）。
圖2. RNA適配體
（圖片來自：doi: 10.1016/j.saa.2022.121760.）
圖3. FRET定量檢測DNA
（圖片來自：doi: 10.1021/acssynbio.9b00103.）
DNA的序列組成決定了酶蛋白的一級結構與催化性能，優勢突變體與相應基因型的物理聯系則是人們最終破譯氨基酸序列的關鍵。至少在高效、便捷的蛋白質測序技術出現之前，核酸和蛋白的一對一關聯對酶的定向進化來說是的。到這，酶定向進化的突變體文庫構建技術、突變體篩選技術、基因型與表型的關聯已經介紹完了。總之，超高通量篩選對于充分發揮定向進化的潛力至關重要，但目前與高效篩選（即快速、準確、靈敏）相匹配的信號放大策略及設備的開發仍有巨大的提升空間。相信隨著酶反應機理及檢測技術研究的不斷推進，未來定向進化的技術將能夠更快實現迭代。
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