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干貨│從原理到應用，帶你全方面了解T4 gene 32 protein

來源：翌圣生物科技（上海）股份有限公司 2023年09月12日 17:28

T4噬菌體基因32編碼蛋白(T4 gene 32 protein，gp32)是一種單鏈DNA（ssDNA）結合蛋白，為T4噬菌體DNA復制和修復所必需。它被廣泛地用于穩定和標記ssDNA區域，以便用電子顯微鏡觀察細胞內DNA的結構、促進限制性內切酶的消化反應、提高RT-PCR中反轉錄的效率、增強T4 DNA聚合酶的活性和提高PCR的產量等。

T4 gene 32 protein的結構

T4 gene 32 protein由301個氨基酸組成，大小為34 kDa，包含三個不同的結構域：核心結構域、N端結構域（NTD）和C端結構域（CTD）。

核心結構域：包含ssDNA的結合位點，并具區分單鏈、雙鏈DNA的能力；
C端結構域（CTD）：涉及異型蛋白相互作用，帶負電荷，調節gp32與復制、修復和重組機制中其他成分的相互作用；
N端結構域（NTD）：負責同型蛋白相互作用，帶正電荷，與鄰近的gp32單體的核心結構域之間通過蛋白-蛋白接觸，使gp32蛋白以頭-尾方向結合ssDNA。

圖1. gp32結構域[1]

T4 gene 32 protein介導的DNA重組修復

DNA損傷時，后隨鏈合成岡崎片段，gp32與前導鏈結合

當前導鏈聚合酶(紅色)在DNA損傷處（X）停滯時，前導鏈和后隨鏈的合成會解耦聯，后隨鏈的合成機制可以合成與受損部位重疊的岡崎片段(綠線)，同時會在停滯的前導鏈聚合酶前面打開一個ssDNA缺口，該缺口被gp32覆蓋(橙色)；

模板子鏈3 '端解旋

gp32單體簇通過阻止Dda解旋酶加載到后隨鏈上來阻止其對復制叉移動的刺激，并促進模板子鏈3 '端的解旋；

模板轉換恢復復制叉移動

UvsX重組酶和Dda解旋酶催化模板轉換來恢復停滯的復制叉；

跨損傷DNA合成

進行后續無錯誤的跨損傷DNA合成。

圖2. gp32介導的重組修復過程[2]

T4 gene 32 protein應用

重組酶聚合酶擴增

（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）

該技術可以在37~42 ℃條件下實現待測靶標的快速檢測，具有反應靈敏度高、特異性強、對儀器依賴程度低且可整合多種檢測模式等優點，特別適用于基層和現場即時檢測，可廣泛應用于體外診斷、獸醫、食品安全、生物安全、農業等領域。

圖3. 重組酶聚合酶擴增RPA技術擴增原理圖[3]

RPA具體流程如下：

重組酶引物復合體的形成

重組酶T4 UvsX在ATP的參與和定位因子（T4 UvsY）的幫助下與擴增引物結合形成重組酶引物復合體，并在雙鏈DNA中尋找同源序列；

重組酶引物復合體定位至同源序列

重組酶引物復合體一旦定位到同源序列，則會插入雙鏈DNA形成D-環結構，啟動鏈置換反應，單鏈結合蛋白gp32會與解開的DNA鏈結合防止進一步被置換；

鏈置換擴增啟動

重組酶T4 UvsX從重組酶引物復合體中被水解，3'端引物暴露并與Bsu DNA聚合酶結合，DNA開始復制延伸，最終兩條母鏈分離，形成兩條新的互補雙鏈DNA。該反應在37-42℃下進行，可在30 min內實現目標序列1012倍的擴增。

核酸依賴性擴增檢測技術

（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification，NASBA）

該技術由一對引物介導，反應在42℃進行，可在2 h左右將模板RNA擴增約109～1012倍，不需特殊的儀器，具有較高的特異性和靈敏度。廣泛應用于病毒、細菌、霉菌、寄生蟲和細胞因子等的檢測，特別是用于艾滋病病毒、丙肝肝炎病毒等RNA病毒的檢測當中。在動物疫病預防控制方面，NASBA方法已成為診斷病毒的國家診斷標準方法之一（GB/T19440-2004 病毒NASBA 檢測方法）。

圖4. NASBA工作流程圖[4]

在NASBA中加入gp32，可以穩定逆轉錄形成的單鏈cDNA，減少NASBA中對熱退火步驟的依賴，提高NASBA程序的簡單性。

其他應用

1）PCR擴增中，使用gp32可以顯著地提高片段的擴增長度及產量[5]，并減輕血紅素、腐殖酸等抑制物的對PCR擴增的抑制作用[6]。如圖5所示，將濃度的抑制劑加入含有5 pg模板DNA的反應混合物中，另外在不添加抑制劑的情況下，檢測0.05、0.5和5 pg模板DNA的擴增情況。結果顯示在PCR體系種添加gp32可顯著減輕抑制劑對PCR擴增的抑制。

圖5. T4 gene 32 protein解除抑制劑對PCR的干擾[6]。A：不含gp32的標準PCR條件；B：含有150 ng/mL gp32的PCR條件

2）Gp32通過阻止模板ssDNA和RNA二級結構的形成，分別增強T7 RNA聚合酶和逆轉錄酶的活性，從而增加體外轉錄和逆轉錄的產量[7]。

翌圣T4 gene 32 protein

翌圣的T4 gene 32 protein由ZymeEditor酶改造平臺重組表達而來，蛋白純度高，核酸酶殘留水平低，批次間穩定性優異，宿主DNA殘留水平極低，適用于RPA、NASBA技術、PCR、NGS文庫構建等應用。

客戶測試案例展示

圖5.客戶測試翌圣重組酶聚合酶核心酶原料擴增結果圖
注：2、4為陽性實驗組；1、3為陰性對照組

客戶采用翌圣Bsu DNA polymerase (Large fragment, 5 U/μL)、T4 UvsX Recombinase (2 μg/μL)、T4 UvsY protein (2 μg/μL)、T4 gene 32 protein (gp 32)、肌酸激酶Creatine Kinase (2 μg/μL) 進行RPA擴增反應，得到正確的目的條帶，且條帶清晰、明亮，結果表明，翌圣重組酶聚合酶擴增核心酶原料可實現高效RPA等溫擴增。

RPA產品推薦

產品名稱	產品貨號	產品作用
Bsu DNA polymerase (Large fragment, 5 U/μL)	11078ES	結合引物與原始靶核酸序列互補合成新的DNA模板
T4 UvsX Recombinase (2 μg/μL)	11079ES	具有配對和鏈轉移活性的重組酶
T4 UvsY protein (2 μg/μL)	11080ES	重組酶輔助因子，刺激T4 UvsX的單鏈DNA依賴性ATP酶活性并降低活性所需的T4 UvsX臨界濃度
T4 gene 32 protein (gp 32) T4噬菌體基因32編碼蛋白	11081ES	參與DNA復制、修復、重組與解鏈后的單鏈DNA結合，防止自雜交
Creatine Kinase (2 μg/μL) 肌酸激酶	14502ES	刺激ATP和肌酸分解為磷酸肌酸和ADP，釋放能量
Exonuclease III (100 U/μL)	14525ES	具有3’→5’外切酶活性，切斷熒光探針中淬滅基團，釋放熒光

參考文獻

[1] Cashen BA, Morse M, Rouzina I, Karpel RL, Williams MC. Dynamic structure of T4 gene 32 protein filaments facilitates rapid noncooperative protein dissociation [published online ahead of print, 2023 Jul 14]. Nucleic Acids Res. 2023;gkad595.

[2] Jordan CS, Morrical SW. Regulation of the bacteriophage T4 Dda helicase by Gp32 single-stranded DNA-binding protein. DNA Repair (Amst). 2015;25:41-53.

[3] 王亞楠, 陳昌國. 重組酶聚合酶擴增技術研究進展[J]. 醫學雜志, 2021, 46(5):8.

[4] Nai YH, Doeven EH, Guijt RM. An improved nucleic acid sequence-based amplification method mediated by T4 gene 32 protein. PLoS One. 2022;17(3):e0265391. Published 2022 Mar 24.

[5] Schwarz K, Hansen-Hagge T, Bartram C. Improved yields of long PCR products using gene 32 protein. Nucleic Acids Res. 1990;18(4):1079.

[6] Kreader CA. Relief of amplification inhibition in PCR with bovine serum albumin or T4 gene 32 protein. Appl Environ Microbiol. 1996;62(3):1102-1106.

[7] Piché C, Schernthaner JP. Optimization of in vitro transcription and full-length cDNA synthesis using the T4 bacteriophage gene 32 protein. J Biomol Tech. 2005;16(3):239-247.

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