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研究課題
海拉細胞的回溯: 細胞系的錯誤鑒定如何誤導了科學文獻
本周推薦
今天推薦的是由荷蘭內梅亨大學社會科學研究所，在2017年04月21日發表的一篇文章，通訊作者是Willem Halffman教授，研究主要闡述了細胞系的錯誤鑒定如何污染了科學研究。
研究背景
01
細胞系的錯誤識別問題是生物醫學科學領域中一個長期存在且棘手的問題，它引發了人們對于實驗數據的準確性和可重復性的擔憂。錯誤的細胞識別可能會對研究結果產生輕微或嚴重的影響，有時甚至會使結果變得毫無意義。
細胞系錯誤識別的問題已經知道了幾十年，始于20世紀60年代圍繞HeLa細胞的爭議。盡管幾次警報和糾正錯誤識別問題的呼吁和倡議繼續困擾著生物醫學研究，但新公布的大規模交叉污染和廣泛使用最近出現的錯誤鑒定細胞系。雖然沒有確切的數字，但細胞系識別錯誤的程度估計在所有細胞系中約占五分之一到三分之一。此外，盡管目前只有488個或0.6%的已知細胞系被錯誤認定，但大多數細胞系很少被使用。被錯誤識別的細胞系在被發現后往往還會長時間以其虛假身份被使用，而其他研究人員也可能在其結果的基礎上進行研究。考慮到對這些細胞系進行的研究的生物醫學性質，錯誤發現的后果可能是嚴重和昂貴的，可能會影響撥款、申請甚至藥物試驗等方面。國際細胞系鑒定委員會(ICLAC)進行的幾個案例研究強調了使用錯誤鑒定細胞系的一些潛在后果。特別是在過去的十年里，這個問題的嚴重性已經得到了廣泛的承認，一些期刊文章、撥款申請的要求，甚至一封致美國衛生部長的公開信都呼吁立即采取行動。
目前，關于采取行動和補救活動的呼吁幾乎集中在避免未來細胞系污染方面，例如通過建立更容易核實細胞系身份的系統。人們提出了多種解決方案，包括使用短串聯重復序列(STR)進行基因型鑒定。此外，作者在進行實驗之前應該檢查細胞系的身份，但很少有人注意到已發表的基于錯誤識別的細胞的研究文章已經造成了損害。雖然存在一些系統，如文章的撤回和更正，可用于提醒其他研究人員潛在問題，但這些系統很少用于標記細胞系的問題。即使未來可以避免細胞系錯誤識別問題，但這些已經被污染的文章將繼續影響研究。
摘要部分
02
雖然細胞系錯誤識別問題幾十年前就已為人所知，但仍有數量不詳的已發表論文在沒有警告或糾正的情況下報告了錯誤的細胞。在這里，研究者團隊試圖對這些“被污染”的文獻做出保守的估計。研究者團隊發現了32,755篇報道錯誤識別細胞研究的文章，這些文章被大約500,000篇其他論文引用。文獻的污染并沒有隨著時間的推移而減少，也不僅僅局限于全球科學的邊緣國家。幾十年來，人們一直試圖阻止細胞系的錯誤識別，但事實證明，這種嘗試是不夠的。文獻的污染需要一個公平合理的通知系統，警告用戶和讀者以適當的小心來解釋這些論文。
方法概述：分配細胞系的過程
為了研究文獻污染的規模，研究者團隊需要了解細胞系的建立、傳播和發表過程。這一過程如下圖1所示。簡單來說，建立一個新的細胞系的過程始于從一個有機體、人類或其他組織樣本中獲得細胞。如果這些細胞成功培養并生長，新細胞系的建立有時會在研究者團隊所稱的“建立論文”中被報道。隨后，科學家可以通過他們的個人網絡或細胞庫分享或獲取該細胞系。這些科學家可能會對這個細胞系進行研究，并在科學期刊上發表他們的發現，從而建立了研究者團隊所說的基于細胞系的原始文獻。
在某些情況下，可能會發現細胞系被錯誤識別。這一觀察結果可能會發表在一份“通知文件”中，從而在國際細胞系認證委員會（ICLAC）的交叉污染或錯誤鑒定細胞系數據庫中進行記錄。根據可用的數據，這些細胞系可以添加到兩種不同的表中：第一種用于沒有已知真實庫存的細胞系的表格；第二種用于已知存在真實庫存的細胞系的表格。這些表格的目的是幫助科學家識別并避免使用已知存在問題的細胞系。
在本文中，研究者團隊關注的是第一類細胞系，即沒有任何原始庫存報道的細胞系。在這種情況下，必須謹慎對待所有的原始文獻，因為它們可能基于錯誤的細胞系，具有不確定性。此外，研究者團隊也試圖估計次要文獻的規模，這些文獻引用了主要文獻，因此可能建立在有問題的材料上，進一步擴散了錯誤。
▲圖1：細胞系的創造、分布和文獻使用: 細胞的培養樣本(藍色細胞)可能產生永生的細胞系(紅色細胞)，在“論文”(白色)中宣布使用。
材料方法
03
1. 數據收集
ICLAC（國際細胞系認證委員會）在2016年12月發布了誤認細胞系清單的8.0版本。研究者團隊從該清單中選擇了表1，其中列出了沒有報告原始假定細胞系的真實庫存的細胞系，總計451個。研究者團隊可以識別引用了錯誤鑒定細胞系的建立文章，或者在標題、摘要或關鍵詞中提到了這些細胞系的文章。研究者團隊在Web of Science數據庫中進行了詳細的引文分析，采用了以下兩種搜索方法，以獲得基于錯誤鑒定細胞系的研究文章數量的保守估計：
方法1。對于ICLAC名單上的每個細胞系，研究者團隊試圖找到報告該細胞系建立的原創文章。研究者團隊首先在Cellosaurus數據庫中搜索這些所謂的“建立文章”，然后參考了德國微生物和細胞系收集（DSMZ）數據庫、美國類型培養收集（ATCC）數據庫和歐洲認證細胞培養收集（ECACC）數據庫。研究者團隊查閱了以上數據庫，以確認是否有關于某個細胞系的已建立文章的引用。研究者團隊找到了255個細胞系的建立文章。接下來，研究者團隊在Web of Science數據庫中搜索這些以建立文章找到的原始論文，并收集了這些文章的所有引用文獻。
方法2。研究者團隊在Web of Science (WoS) 數據庫中進行了一項搜索，旨在檢索所有包含451個細胞系名稱之一的文章，同時還包含單詞“cell(s)”或“cell line(s)”在標題、摘要或關鍵詞中的文章。為了提供更準確的搜索結果，研究者團隊選擇了WoS數據庫中最常見的25個研究領域(按WoS定義)，僅對這些領域的文章進行了分類。這一策略有助于排除那些在細胞系研究較不常見的領域中使用錯誤鑒定細胞系的文章。值得注意的是，盡管WoS定義的研究領域可能存在重疊，但研究者團隊對多個研究領域的文章進行分類不會導致研究者團隊的分析中的重復計算。換句話說，對于包含在這25個確定的研究領域之一中的所有文章，研究者團隊只計算一次，以確保數據的準確性和一致性。
2. 數據驗證
研究者團隊采用了幾種策略來驗證數據的準確性，并減少“假陽性”的數量，即那些文章最終出現在研究者團隊的樣本中，但沒有報告使用錯誤鑒定細胞系的研究。對于搜索方法1，研究者團隊進行了詳細的驗證，涵蓋了數據庫中產生至少100個主要文章命中的建立文章（總共41篇）。在核實過程中，研究者團隊發現其中一篇文章實際上是一篇通知論文，而不是一篇建立文章，因此將其從研究者團隊的搜索結果中刪除。此外，研究者團隊還發現了四篇文章，報告了幾種細胞系的建立，其中一些未列入拉加經委會數據庫。在其中兩種情況下，建立文章報告了污染細胞系的建立以及污染細胞系的建立（EJ138和HPB-MLT）。
搜索方法2：由于一些細胞系的名稱容易與其他含義混淆（例如，“WISH”，“CaVe”或“EU-1”），這種搜索產生了噪音。因此，研究者團隊采用一個迭代過程來刪除這些噪音。隨后，隨機選擇100篇文章的過程迭代4次，由兩位作者獨立執行。從隨機樣本的結果來看，研究者團隊的搜索方法提供了可靠的結果。然而，結果不可避免地包含剩余的假陽性，根據研究者團隊對該集合的隨機樣本的驗證，估計其程度最大可達受污染的主要文獻的10%，其中發現6.5%的文章由假陽性組成。文章使用ICLAC注冊的細胞，但報告了其正確的來源(如Vaughan等人對KB細胞的報道)。
3. 案例研究
為了驗證收集到的數據，并更深入地了解基于錯誤識別細胞系的知識是如何通過文獻傳播的，研究者團隊進行了三個案例研究，跟蹤了有關單個細胞系或細胞系家族的出版物。這三個案例研究都涉及到錯誤鑒定的細胞系，沒有報告原始庫存，是從拉加經委會數據庫中隨機選擇的。這三個案例研究的細胞系包括胸腺細胞系家族（F2-4E5、F2-5B6、P1-1A3和P1-4D6）、ALVA-31和JCA-1。案例研究的結果表明，研究者團隊的搜索方法確實提供了準確的數據，只有很少的“假陽性”，并且相當保守地估計了基于錯誤識別細胞系的研究文章數量。
4. 污染文獻來源分析
根據WoS數據，研究者團隊對污染文獻的來源進行了分析，包括污染文獻的時間、地理來源以及在研究領域中的分布。研究者團隊將污染原始文獻的來源與涉及細胞系研究的所有文獻進行了比較。這些文獻包括在標題、關鍵詞或摘要中提到以“細胞”開頭的任何單詞的文章，因此不僅包括錯誤識別的細胞文獻。這個文獻總數來自WoS定義的25個最常見的研究領域之一，并用來估計相關總文獻中有多少部分可能被污染了。
結果：科學文獻的污染
05
研究者團隊的研究利用ICLAC的交叉污染或錯誤鑒定細胞系數據庫以及Web of Science (WoS)，通過一系列互補的搜索策略來識別基于錯誤鑒定細胞系的研究文章。截止到2017年8月4日，研究者團隊能夠識別出32,755篇這樣的文章。需要指出的是，這個數字是對污染規模的保守估計，因為研究者團隊只搜索已知被錯誤鑒定的細胞系。此外，為了避免誤報，研究者團隊排除了一些細胞系，如具有非標識符的細胞系或已經驗證庫存仍在流通的細胞系。在這里，非標識符是指細胞系的名稱，可能不僅指代該細胞系本身，還可能指代其他不同現象。例如，"of"細胞系或"WISH"細胞系的情況。使用“非標識符”，研究者團隊不指代具有多個名稱或具有多個拼寫的細胞系(例如腸407細胞系，也稱為“testine407”，“Int-407”和“Int407”)。在細胞系名稱有多種拼寫的情況下，研究者團隊堅持使用ICLAC數據庫中指示的拼寫。因此，研究者團隊可能在搜索方法2中遺漏了許多使用這些細胞系的文章，再次導致保守估計。
此外，基于錯誤鑒定細胞系的研究對科學文獻產生了廣泛的影響，因為這些研究論文的引用率相對較高。雖然WoS不允許精確統計引用次數，但研究者團隊可以通過文獻的“二次污染”跡象來衡量其影響。對主要的污染文章引用進行分析，研究者團隊發現有46篇論文被引用超過1000次，而有2600多篇污染文章被引用超過100次。此外，超過92%的被污染論文至少被引用了一次，這個比例高于生物醫學文獻的平均水平。總的來說，研究者團隊保守估計原始污染文獻的總引用次數超過50萬次，這還不包括自我引用，這意味著它們在相當大一部分生物醫學文獻中留下了痕跡。需要注意的是，文章被引用的原因各不相同，其中一些引用可能是出于負面評價，甚至是一種儀式性的引用。因此，并不是所有被引用的文章都一定包含（嚴重的）錯誤。然而，基于錯誤鑒定細胞系的研究數量仍然是一個令人擔憂的問題，需要引起關注。
關于細胞的研究文章的總數估計在450萬到500萬之間(見方法)。因此，受污染的一級文獻占細胞相關文獻總數的0.8%以下，而(潛在)受污染的二級文獻估計占該領域總研究產出的10%左右。然而，研究者團隊應該強調，研究者團隊的目標是衡量問題的嚴重程度。樣本無疑含有假陽性，因此不適合識別個別污染。
關于細胞的研究文章的總數估計在450萬到500萬之間(見方法)。因此，受污染的一級文獻占細胞相關文獻總數的0.8%以下，而(潛在)受污染的二級文獻估計占該領域總研究產出的10%左右。然而，研究者團隊應該強調，研究者團隊的目標是衡量問題的嚴重程度。樣本無疑含有假陽性，因此不適合識別個別污染。
更仔細地檢查原始文獻
對研究者團隊的發現的反對意見可能是，研究者團隊的一般搜索方法沒有提供一個適當的概述，具體的被錯誤識別的細胞系實際上如何影響研究。為了更深入地了解基于錯誤識別細胞系的知識是如何通過文獻傳播的，研究者團隊提出了三個案例研究，其中研究者團隊跟蹤了有關單個細胞系或細胞系家族的出版物。所有這三種細胞系都是錯誤鑒定的細胞系，沒有原始庫存的報告，是從拉加經委會數據庫中隨機選擇的。
ALVA-31：該細胞系最初于1993年作為人類前列腺癌建立，但在2001年發現與另一種人類前列腺癌PC-3細胞系相同。研究者團隊發現56篇文章引用了ALVA-31，而ALVA-31被2615篇文章引用。在這56篇論文中，有22篇是在發現ALVA-31細胞系錯誤鑒定后發表的。仔細檢查這22篇文章，就會發現其中20篇文章實際上使用了ALVA-31細胞系，而只有兩篇文章提到了細胞系的錯誤識別。值得注意的是，描述基于ALVA-31細胞的研究的最新文章發表于2016年，也就是錯誤識別報告的15年后。
在這種情況下，有人可能會爭辯說，使用ALVA-31細胞，而實際上使用PC-3細胞，可能沒有什么害處，因為兩者都是人類前列腺癌，并且有許多共同的特征。然而，在某些情況下，甚至研究人員自己也認為ALVA-31的精確身份至關重要:“為了排除細胞類型特異性效應，研究者團隊將ALVA-31的研究擴展到其他人類PCa細胞類型”。隨后，作者解釋了他們如何在其他研究中使用PC-3細胞來“排除細胞類型特異性效應”;實際上是比較兩個相同的細胞系。
胸腺細胞系：1994年的一篇報道宣布建立了一組新的胸腺細胞系(F2-4E5、F2-5B6、P1-1A3和P1-4D6)。在MacLeod等人的一篇報道中，發現細胞系被錯誤識別，實際上來源于肝肝癌。總共有69篇文章提到了這些細胞系，反過來又有2092篇文章被引用。在主要的文章中，有43篇是在MacLeod等人的報告之后發表的，最近的一篇是在2016年底才發表的。在最近的15篇提到1994年報告的文章中，有13篇實際上提到了它，因為它們使用了細胞系，所有13篇報道了胸腺細胞的研究，沒有提到任何對這些細胞系的錯誤識別的知識。另外兩篇是指該建立文章所采用的建立新細胞系的方法。
JCA-1：JCA-1細胞系最早建立于1990年，2001年van Bokhoven等人發現JCA-1細胞系實際上來源于膀胱癌，而不是前列腺癌。研究者團隊發現有64篇文章引用了該論文，或在標題、關鍵詞或摘要中明確提到了JCA-1。反過來，這些文章被3352篇文章引用。在主要文章中，有18篇出現在van Bokhoven等人的報告之后。與之前討論的細胞系相比，JCA-1在科學研究中似乎沒有當代的應用:最近一篇描述使用該細胞系研究的文章可以追溯到2009年。然而，同樣在這種情況下，在人們知道JCA-1實際上起源于膀胱癌之后，發表了幾篇文章報道使用“前列腺癌細胞系”。事實上，正如研究者團隊在全文中驗證的那樣，在van Bokhoven等人的報告之后發表的18篇文章中，只有3篇表示意識到這條線被錯誤識別了。相比之下，14人只是簡單地聲明使用了JCA-1細胞系，絕大多數人明確地將它們稱為前列腺癌細胞。
研究結論：明顯被錯誤識別的細胞系繼續對研究產生影響，要么直接是因為科學家們一直在使用它們，要么間接是因為科學家們在以前使用錯誤識別的細胞系的基礎上進行研究。
一個暫時的問題?
有人可能會想，研究文獻的污染是否主要是過去的問題，因為半個世紀前就表達了對錯誤鑒定細胞系的第一次關注，并且自那以后有許多舉措試圖緩解這一問題。
基于32,755篇原始污染文獻記錄，研究者團隊分析了這些文章的發表日期。大多數文章(57%)是2000年以后寫的，使用錯誤鑒定的細胞系的文章數量仍在增長(見圖2)。顯然，這個問題絕對不是過去的問題，而是與當代科學非常相關，甚至在2017年2月出現了58篇基于污染文獻的新文章。
圖2顯示了歷史細胞系污染變得明顯的三個時刻。首先，通過Stanley Gartler的工作，檢測種內細胞污染成為可能，之后在1968年Nature上報道了幾種涉及HeLa細胞的污染。其次，Walter Nelson-Rees等人在20世紀70年代的工作將細胞培養污染提上了全球研究議程，并于1981年在《科學》雜志上列出了受污染的細胞培養物，證明了HeLa細胞對細胞培養物的大規模污染。從這一點開始，可以預期，在那些經常使用細胞培養的研究領域工作的大多數科學家都意識到他們的研究材料的潛在問題。然而，絕大多數基于錯誤鑒定細胞系的研究論文都是在這個時間點之后發表的。即使在2001年引入STR后，每年的數量也沒有減少。
▲圖2. 多年來被污染的原始文獻的分布
研究結論：通過引用使用錯誤鑒定的細胞系的文章來污染文獻仍然是一個非常局部的問題。
外圍問題
對研究者團隊研究結果的另一個反對意見可能是，交叉污染尤其發生在有新的或新興的研究社區的地區，在這些地區，培訓水平或使用測試設施的機會可能有限。例如，最近的一些出版物表明，中國的細胞系污染水平在25%和46%之間，并證明在中國開發的所有“新”細胞系中，85%實際上是海拉細胞。
然而，大多數使用錯誤鑒定細胞系的文章來自具有良好研究傳統的國家(如美國、日本、德國)。相對于他們在總研究產出中所占的份額，這些國家的作者經常對錯誤識別的細胞系進行研究。事實上，主要由于他們在細胞系文獻中所占的巨大份額，超過36%的受污染的原代文獻來自美國。圖3顯示了每個國家細胞中被污染的原代顆粒占總顆粒數的百分比(參見補充資料S2文件)。它包括25個受污染原始文獻最多的國家。在這份榜單中，研究者團隊看到擁有優秀研究聲譽的國家排名很高。因此，這一問題不僅發生在研究質量和勤奮標準較低的地區，而且也發生在擁有研究聲譽的國家。然而，對過去五年的文獻分析顯示，中國在污染文獻中的份額急劇上升，證實了文獻中最近表達的擔憂。
最后，研究者團隊分析了哪些研究學科受誤認細胞系使用的影響最大。圖4顯示了污染物品在WoS定義的各個研究區域的分布情況。在受污染的初級文獻中，腫瘤學、生物化學/分子生物學、藥理學和細胞生物學受到的影響最大，證實了對醫學應用的擔憂。
然而，對原始文獻的引文分析表明，二次文獻的研究范圍更為廣泛。二級文獻中的文章也來自很少使用細胞系進行研究的領域，如精神病學、工程學和農業科學，見圖4。因此，錯誤鑒定的細胞培養的影響可能會蔓延到非生物醫學領域，并影響那些沒有受過訓練來判斷錯誤鑒定的細胞系研究的有效性的科學家。
▲圖3：受污染的原代物品占每個國家細胞上物品總數的百分比。
▲圖4：被污染的原始文獻在Web of Science定義的研究領域的分布
研究結論：錯誤鑒定的細胞培養的影響可能會蔓延到非生物醫學領域，并影響那些沒有受過訓練來判斷錯誤鑒定的細胞系研究的有效性的科學家。
改進措施
在過去的幾十年里，人們對細胞系鑒定檢測的改進給予了極大的關注。1967年Gartler引入遺傳標記后，細胞系的鑒定，從而證明交叉污染的能力成為可能。隨后，引入了許多細胞系鑒定技術，首先是帶狀標記染色體的檢查，然后是染色體模式和結構的可視化，隨后是人類白細胞抗原(HLA)分型、酶多態性和DNA多態性的方法。最近，引入了“DNA指紋”技術和位點特異性探針的使用。最后，這導致了現在的短串聯重復譜分析的標準方法。正如最近所指出的那樣，正確的細胞系鑒定技術現在已經廣泛可用。然而，由于時間和資金限制、缺乏培訓和缺乏(國際)標準等多種原因，這些技術的實施仍然不足。
盡管采取了鑒定新細胞系和現有細胞系的措施，但基于錯誤細胞的研究仍然存在于文獻中，事實上還在繼續發表。對污染物品進行某種形式的預防性標簽似乎是不可避免的。然而，這種補救行動應該是相稱的，不能造成不必要的損害。對于一些科學家個人、研究部門或科學期刊來說，輕率的措施可能會帶來痛苦。事實上，一些研究人員在研究者團隊被污染的原始文獻中撰寫了一百多篇文章。盡管這些文章的問題幾乎屬于“無心之過”的范疇，但在無意欺騙的情況下，通知所有這些文章有潛在的錯誤，或者更糟的是:撤回它們，將對一些科學家的職業生涯產生不成比例的影響。這將破壞而不是支持有效的清理行動。然而，除了從源頭捕獲細胞系污染外，迫切需要在已發表的文獻中標記污染“下游”的舉措。研究者團隊可以提出幾點建議。
首先，應該在先前發表的使用錯誤識別細胞系的文章旁邊發布通知。這可以以“關注的表達”的形式來完成，它被描述為“既不是撤回也不是更正，它們提醒讀者一篇論文可能存在問題，而整個故事還不清楚。”這樣的通知也將有助于盡可能多地保存有價值的數據。 其次，為了方便將來識別使用錯誤細胞系的文章，研究者團隊建議作者在文章中易于搜索的部分(如關鍵詞或摘要)中提及所使用的細胞系。
此外，可以更好地利用紙質記錄來確定細胞系的來源。對細胞系的起源以及各種驗證測試、它所參與的實驗和這些實驗產生的結果進行清楚和完整的概述，將對檢查細胞系的狀況和質量大有裨益。此外，當發現細胞系被錯誤識別時，這將允許容易地識別潛在的錯誤研究。
除了用于識別錯誤研究之外，書面記錄還可以用于其他目的，例如繪制某一細胞系的現有知識圖譜(允許簡單地識別知識空白)，并為發表細胞系實驗的負面結果提供一個平臺。長期以來，這類結果的發表一直被認為是促進研究誠信的一種方式。
在第一次對錯誤鑒定細胞系的關注近半個世紀之后，改進鑒定的舉措需要得到對已經被污染的文獻的關注的補充，是艱巨而緊迫的。
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技術簡介
STR ( Short Tandem Repeat, 短串聯重復序列)基因分型技術是細胞身份鑒定最準確有效的方法，被ATCC、ICLAC等機構認定為細胞鑒定的金標準。STR基因位點由長度為3~ 7個堿基對的短串連重復序列組成，廣泛存在于人類基因組中，被稱為細胞的DNA指紋。通過對這些STR位點的檢測，將檢查結果與專業的STR數據庫比對，從而確定被測細胞的真實身份，或判斷被測細胞是否與某些細胞，發生交叉污染。
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