基本原理：
免疫印跡（Western Blot） 采用的是聚丙/烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。SDS-PAGE 可對蛋白質(zhì)樣品進行分離，轉(zhuǎn)移到固相載體——例如硝酸纖維素薄膜（NC）上。固相載體可以吸附蛋白質(zhì)，并保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。轉(zhuǎn)移后的 NC 膜就稱為一個印跡（blot），用蛋白溶液（如 5%BSA 或脫脂奶粉溶液）處理，封閉 NC 膜上的疏水結(jié)合位點。用目標蛋白的抗體（一抗）處理 NC 膜——只有待研究的蛋白質(zhì)才能與一抗特異結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，這樣清洗除去未結(jié)合的一抗后，只有在目標蛋白的位置上結(jié)合著一抗。用一抗處理過的 NC 膜再用標記的二抗處理，二抗是指一抗的抗體，如一抗是從鼠中獲得的，則二抗就是抗鼠IgG 的抗體。處理后，帶有標記的二抗與一抗結(jié)合形成抗體復(fù)合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白質(zhì)的位置。

操作步驟：

1.組織或細胞裂解：將需要檢測的細胞或組織樣本進行裂解，以釋放蛋白質(zhì)。常用的裂解緩沖液包括RIPA緩沖液和NP-40緩沖液等。

2.蛋白質(zhì)濃度測定：使用蛋白質(zhì)濃度測定方法（如BCA或Bradford法）確定樣品中的總蛋白質(zhì)濃度。

3.蛋白質(zhì)電泳：將樣品中的蛋白質(zhì)根據(jù)大小通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離。在電泳過程中，樣品通常會與還原劑（如β-巰基乙醇）和離子變性劑（如SDS）混合，以使蛋白質(zhì)變性并帶有負電荷。

4.轉(zhuǎn)膜：將分離的蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到聚合物膜（通常是聚偏氟乙/烯膜或硝酸纖維素膜）上。這通常通過電泳轉(zhuǎn)?。╡lectroblotting）完成，其中將膜與凝膠層疊放置，并應(yīng)用電流使蛋白質(zhì)遷移至膜上。

5.阻斷：將膜放入含有蛋白質(zhì)阻斷劑（如牛血清蛋白、脫脂奶粉或魚膠）的緩沖液中，以阻止非特異性結(jié)合。

6.一抗孵育：將膜與目標蛋白質(zhì)特異性的一抗（抗體）溶液孵育，使一抗與目標蛋白質(zhì)發(fā)生特異性結(jié)合。

7.洗滌：用緩沖液反復(fù)洗滌膜，以去除非特異性結(jié)合的一抗。

8.二抗孵育：將膜與與一抗的宿主物種不同、帶有酶標記的二抗孵育。二抗將特異性地與一抗結(jié)合。

9.再次洗滌：用緩沖液反復(fù)洗滌膜，以去除非特異性結(jié)合的二抗。

10.信號檢測：添加特定底物（如光敏底物或發(fā)光底物），使酶標記的二抗產(chǎn)生可觀察的信號。該信號通常是光輻射或發(fā)光。

11.成像和分析：使用化學(xué)發(fā)光設(shè)備（如X光片或光學(xué)成像系統(tǒng)）記錄膜上的信號，并進行定量分析。

PS：在每一步中因采用的具體實驗方法不同, 可構(gòu)成多種免疫印跡分析系統(tǒng)。