在生物制劑配方的酸堿條件下或者具有脂肪酶/酯酶活性的殘存的宿主細胞蛋白（HCP）的催化作用下，吐溫可能發生水解，見圖 1。吐溫的降解不僅降低了表面活性劑的真實濃度，而且還與不溶性微粒的形成有關。中藥注射液和化學藥品注射液亦是常用吐溫作為增溶劑、乳化劑或分散劑，制劑通常也會根據主藥的化學性質進行 pH 值的調節，弱的酸堿條件下同樣會導致吐溫的水解。吐溫原料本身的質量也有較大的差異，同時在長期的儲存和流通中也會產生不同程度的水解。

對吐溫原料及其相關的不同類型制劑中的長期穩定性和安全性的關注促進了吐溫表征和定量的分析方法的發展。安捷倫公司與科邁恩以及中國醫學科學院/協和醫學院藥物研究所合作建立了吐溫表征和檢測的系列方案，如 UHPLC/QTOF 結合 Polymer Studio 軟件用于吐溫組成和降解產物精細表征，詳細內容可參考往期微信推送。基于游離脂肪酸結構中無明顯發色基團，并且抗體制劑中游離脂肪酸的含量較低，選擇了靈敏度高、專屬性強并且操作簡單的單四極桿質譜法來檢測游離脂肪酸。安捷倫實驗室應用 ICH Q14 分析方法開發指導原則的 AQbD（analytical Quality by Design）理念開發了基于 UHPLC-MSD 單四極桿質譜的游離脂肪酸含量測定方法。

采用 Agilent 1290 Infinity 液相色譜系統，配備如下：

色譜柱 Agilent Zorbax SB-C18 2.1 ×50 mm, 1.8 μm

樣品前處理：操作簡單，進行簡單的蛋白沉淀，離心取上清液過濾后直接進樣分析。

色譜質譜條件摸索：基于 ICH Q14 分析方法開發指導原則，進行色譜和質譜條件的摸索，如下表所示

分析方法色譜條件確定后，并按照 ICH Q2 的要求進行了方法學驗證。

用開發的方法對三個不同的抗體樣品中的游離脂肪酸進行分析，具體結果如下：

參考文獻：

[1] 賈東辰，何伍，中國新藥雜志，2022，31（10）933-936.

[2] Maximilian N. Honemann, Jan Wendler, Tobias Graf, Anja Bathke, Christian H. Bell,

Journal of Chromatography B，1116 (2019) 1–8.