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克隆技術，又稱為“生物放大技術”，目前應用泛的技術為“分子克隆”，即通過重組技術將目的DNA片段按照人們的設計定向連接起來，在特定的受體細胞中與載體同時復制并得到表達，產生新的遺傳性狀的技術。
前兩期小翌給小伙伴們介紹了一些傳統的、應用范圍廣的、新型的分子克隆方法。相信大家已經發現，大部分的分子克隆方法，諸如傳統分子克隆、TA克隆、Gatway克隆、TOPO克隆、無縫克隆等都繞不開目的片段制備、載體制備、連接、轉化、篩選等等步驟，接下來小翌就具體解析一下載體和目的片段制備的過程，為您的實驗提供好方法。
圖1.無縫克隆關鍵步驟
目的片段：目的片段來源為基因組DNA、另一質粒的一部分或者線性DNA片段等。制備目的片段時常用的方法有兩種，方法一是通過PCR擴增片段或者載體上的目的序列，在此過程中，如果制備目的片段是為了在下游進行傳統的酶切酶連方式，就需要引入限制性酶切位點，設計與線性載體兩端相同的酶切位點，以便酶切后通過匹配的粘性末端進行連接；如果制備目的片段是為了在下游進行同源重組，則需要引入15-25 bp的上下游同源臂。
首先，通過翌圣的無縫克隆引物設計軟件 設計引物。輸入需要的載體序列和目的片段序列，選擇合適的酶切位點，生成引物，如圖2所示。
圖2.翌圣引物設計流程
值得注意的是，多個目的片段插入的雙酶切位點，實際添加到第一個片段的5’端和最后一個片段的3’端，中間片段不含有設計的酶切位點。之后，通過引物合成公司合成需要的引物序列。接著，利用PCR技術擴增目的片段，如使用翌圣高保真PCR試劑盒（Cat#10164ES），包含高保真DNA聚合酶，擴增目的片段快速簡便、靈敏度高、特異性強；或使用翌圣快速PCR試劑盒（Cat#10157ES），3 kb以內基因組等復雜模板擴增速度可達1-3 sec/kb，5 kb以內質粒等簡單模板擴增速度可達1 sec/kb，具有Taq DNA聚合酶，擴增后的PCR產物具有3’-dA突出端，可輕松克隆至T載體。
圖3. 10906ES連接2000 bp（50 ng）粘性末端片段圖
A：載體和片段均來自南京某高校；B：插入片段PCR鑒定電泳圖
擴增后產物需要進行純化。有兩種方法，一種是使用翌圣瓊脂糖（Cat#10208ES）配制凝膠，電泳后切割出目標片段進行純化，如使用翌圣的瓊脂糖凝膠回收試劑盒（Cat#19101ES）能保證實驗流程高效、結果可靠、得率高。另一種是直接取PCR產物純化，如使用翌圣PCR產物純化試劑盒（Cat#19106ES），操作簡便，15 min即可完成PCR產物純化。
載體：將目的DNA序列通過基因工程手段送到受體細胞所需的運載工具。常見的載體有質粒，病毒和噬菌體。當前基因工程中的載體是質粒。
所有基于質粒的克隆載體包括：確保在細菌宿主細胞內能有效增殖的復制原；單一酶切位點，或多克隆位點（MCS），后者含有一系列酶切位點，可供目的片段插入；載體成功轉化后的細菌篩選標記（例如，抗生素耐受）。
pET系列載體是目前應用泛的重組蛋白表達載體，載體構建時目的片段被克隆入載體噬菌體T7轉錄翻譯系統下，經轉化在宿主T7 RNA聚合酶的誘導下進行表達。T7 RNA聚合酶具有并特異的啟動T7啟動子基因表達功能，當其被誘導時，可使宿主本身的表達幾乎全部轉化為目的基因的表達，誘導幾個小時后即可使得最終目的基因表達產物超過細胞總蛋白的50%。
翌圣pET-28a(+) Vector表達載體（Cat#11905ES）載體帶有一個N端的His/Thrombin/T7蛋白標簽，同時含有一個可以選擇的C端His標簽，還有單一的多克隆位點，方便目的片段的克隆與表達，載體圖譜如圖4所示。
圖4. 翌圣pET-28a(+) Vector表達載體圖譜
準備好載體后，即可進行載體的制備。其與目的片段制備方法相同，可通過PCR擴增或限制性內切酶酶切獲得線性化載體。限制性內切酶的選擇取決于載體和插入片段上是否存在相應的識別序列、識別序列的位置以及是否適于連接。MCS往往是插入片段的，因為該區域專用于克隆。
翌圣的FuniCut™快速限制性內切酶能快速、精準完成DNA切割。載體酶切后，為防止自連，有必要進行載體的去磷酸化，尤其當載體酶切后末端可互補或是平端時。載體的去磷酸化對于降低背景、促進所需片段插入載體非常重要，翌圣小牛腸堿性磷酸酶（Cat#10321ES）可將DNA、RNA的5’端磷酸基團去除，有效阻止載體的自連現象。獲得的線性化載體也需要純化回收后使用。
圖5. 小牛腸堿性磷酸酶去DNA磷酸化示意圖
經過上述步驟，載體和目的片段都已整裝待發，是時候開展下一步的載體和片段連接反應了。那么連接反應中應用到的技術和試劑又有哪些呢？關注我們，小翌會在下一期的分子克隆技術專題中給大家具體講解分子克隆連接中應用到的技術，為您的實驗帶來新的思路與方向，期待下一次的見面~
產品定位 | 產品名稱 | 產品貨號 | 規格 |
5s/kb，高保真PCR（含上樣染料） | 2× Hieff Canace® AdvanceFast PCR Master Mix (With Dye) | 10164ES03/08 | 1 mL/5×1 mL |
快速PCR，快至1s/kb | 2×Hieff® Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix(with Dye) | 10157ES03/08 | 1 mL/5×1 mL |
常規PCR | 2×Hieff® PCR Master Mix(With Dye) | 10102ES03/08 | 1 mL/5×1 mL |
兼容TA/平末端克隆 | Hieff Clone® Universal Zero TOPO TA/Blunt Cloning Kit | 10906ES08/20 | 5 T/20 T |
高質量瓊脂糖 | Agarose瓊脂糖 | 10208ES60/76 | 100 g/500 g |
瓊脂糖凝膠回收試劑盒 | MolPure® Gel Extraction Kit 瓊脂糖凝膠回收試劑盒 | 19101ES50/70 | 50 T/200 T |
PCR產物純化試劑盒 | MolPure® PCR Purification Kit PCR產物純化試劑盒 | 19106ES50/70 | 50 T/200 T |
表達載體 | pET-28a(+) Vector 表達載體 | 11905ES03 | 1 μg |
去DNA磷酸化 | Alkaline Phosphatase(30 U/μl),Calf Intestine(CIAP) 小牛腸堿性磷酸酶 | 10321ES80 | 1000 U |
通用緩沖液，5min完成精準酶切 | FuniCut™快速限制性內切酶 | 15001ES-15051ES | 50 T |
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