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關于USER酶混合物的應用，看這篇就夠了！

來源：翌圣生物科技（上海）股份有限公司 2023年11月05日 21:18

尿嘧啶特異性切除試劑（Uracil-Specific Excision Reagent , USER）是由尿嘧啶DNA糖基化酶（Uracil DNA Glycosylase, UDG）和核酸內切酶 Ⅷ(Endonuclease VIII, Endo Ⅷ)（戳鏈接了解詳情）兩種酶混合而成。UDG識別ssDNA或dsDNA上的dU堿基并形成AP位點，但磷酸二酯骨架結構保持完整。Endo VIII的裂解酶活性能夠使AP位點的3′和5′端的磷酸二酯鍵斷裂，釋放無堿基的脫氧核糖，形成單核苷酸間隙。因此，USER酶混合物能在DNA的dU位置產生一個單核苷酸缺口，適用于ssDNA、dsDNA及環狀DNA，可應用于

RNA鏈特異性文庫構建；
尿嘧啶特異性刪除介導的克隆（USER-LIC）；
TALE基本單位的組裝；
單細胞多個cDNA串聯建庫。

圖1. 切除dUTP示意圖

Uracil-Specific Excision Reagent的應用

RNA鏈特異性文庫構建

RNA測序（RNA-seq）已成為全轉錄組水平研究差異基因表達和mRNA差異剪接的工具，具有更準確、可重復、廣泛和可靠的特點。RNA-seq的基本流程包括：提取RNA、建立cDNA文庫、上機擴增測序、數據分析。其中RNA-seq文庫構建包括常規建庫和RNA鏈特異性建庫兩種方法。在常規mRN建庫的流程中，由于我們在雙鏈cDNA的兩端加上的接頭是對稱的，這樣得到的文庫在測序后，無法判斷測出來的reads是來自正鏈還是負鏈。為了避免普通RNA-seq無法區分轉錄本方向的問題，后來出現了鏈特異的文庫構建方法。鏈特異性RNA-seq保留了轉錄本的方向信息，可以確定reads是來源于正鏈或負鏈，使得基因定量和可變剪切事件檢測更準確。如圖2所示，利用dUTP標記cDNA二鏈，USER酶混合物使標記鏈被降解，可以實現鏈特異性RNA-seq文庫構建。

技術路線：

使用引物合成RNA對應的cDNA第一鏈；

使用dUTP取代dTTP合成cDNA的第二條鏈；

末端修復、3’加A、接頭連接；

去除含dUTP的cDNA鏈：用USER酶混合物處理，將含有dUTP的cDNA鏈去除，留下cDNA一條反鏈；

PCR 擴增，上機測序。

圖2. 常規RNA建庫與鏈特異性文庫構建對比[1]

尿嘧啶特異性刪除介導的克隆（USER-LIC）

USER-LIC是一種不依賴限制酶切位點，實現無痕克隆以及多片段同時組裝的新型體外重組克隆。USER-LIC主要是通過USER酶混合物特異性識別和刪除擴增的雙鏈DNA片段中的dUTP，從而實現重疊DNA序列長度的可控。

技術路線：

擴增：用含dUTP的引物擴增目的片段和載體；

切除dUTP：將得到的兩種線性片段用USER酶混合物處理，使它們暴露互補的粘性末端；

連接與轉化：將帶有互補粘性末端的兩種線性片段混合后轉化到大腸桿菌感受態細胞中，經過篩選獲得目標質粒。

圖3. 克隆示意圖[2]

助力TALE技術，構建TALE基本單位

TALE技術（Transcription activator-like effector , TALE）是一種熱門的基因編輯工具，能夠精準編輯DNA。TALE的基本單位是一個可以識別不同堿基的蛋白domain，一個domain可以識別一個堿基，所以要構建一個識別多個連續DNA堿基的TALE就需要多個對應的基本蛋白domain。使用USER-LIC的方法，可以高效地合成這些基本單元，然后將它們有序組裝成最終的TALE工具。這種技術在低脫靶率等方面具有優勢，被廣泛用于各種基因編輯工具的開發。

技術路線：

擴增：使用含有dUTP的引物擴增每個特定的TALE基本單位的編碼基因；

切除dUTP：使用USER酶混合物切除dUTP，在每個基本單位的編碼基因DNA兩端保留一段特定的粘性末端；

組裝：這些粘性末端按照預先設計的順序排列，以確保所有基本單位按順序組裝連接成最終靶向特定序列的TALE工具。

圖4. 基于尿嘧啶切除克隆的TALE組裝示意圖[3]

助力HIT-scISOseq技術，將單細胞多個cDNA串聯建庫

HIT-scISOseq技術由華大基因唐沖博士團隊和中山大學眼科中心眼科國家重點實驗室劉奕志院長團隊共同開發，該技術利用USER酶混合物在cDNA兩個末端產生粘性末端，從而實現單細胞多個cDNA串聯建庫，結合PacBio平臺（CCS）測序，以實現高通量和高精度的單細胞RNA亞型測序研究。

技術路線：

獲得單細胞cDNA：借助10X Genomics 平臺，獲得單細胞全長cDNA；

擴增cDNA：利用生物素化的含dUTP的PCR引物對全長cDNA進行擴增；

捕獲cDNA：然后使用鏈霉親和素珠捕獲擴增的生物素化的cDNA；

切除dUTP：使用USER酶混合物切除dUTP，在cDNA的兩個末端產生粘性末端；

連接與測序：使用DNA連接酶連接多個cDNA構建CCS文庫后進行長讀長測序。

圖5. HIT-scISOseq單細胞全長轉錄組數據的技術流程[4]

翌圣Uracil-Specific Excision Reagent

翌圣Uracil-Specific Excision Reagent（Cat#14537ES）由翌圣生物分子酶改造平臺———ZymeEditor™經過重組表達獲得的Endo VIII（Cat#14536ES）與UDG（Cat#14455ES）的混合酶，無核酸酶、RNase殘留，低宿主殘留，適用于dUTP切除、USER-LIC、RNA鏈特異性建庫以及單細胞cDNA串聯建庫等領域。

數據展示

dUTP切除效果與進口品牌N*一致

分別使用翌圣的Uracil-Specific Excision Reagent（1 U/μL）與進口品牌N*的同類產品（1 U/μL）切除10 pmol含dUTP的雙鏈DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果表明，翌圣Uracil-Specific Excision Reagent與進口品牌N*的切除效果一致。

圖6. dUTP切除效果對比圖

USER-LIC效果優于進口品牌N*

分別使用翌圣的Uracil-Specific Excision Reagent（1 U/μL）和進口品牌N*的同類產品（1 U/μL）連接600bp DNA片段構建載體，并導入到大腸桿菌中培養，觀察培養皿上的菌落數，結果表明，翌圣Uracil-Specific Excision Reagent應用于USER-LIC效果優于進口品牌N*。

圖7. 菌落數對比

客戶反饋

RNA鏈特異性建庫性能與進口品牌N*一致

客戶測試翌圣14537ES與進口品牌N*的RNA鏈特異性建庫性能，擴增曲線表明翌圣Uracil-Specific Excision Reagent與進口品牌N*的RNA鏈特異性建庫性能一致。

圖8. qPCR擴增曲線

相關產品推薦

應用	產品名稱	產品貨號
dUTP切除，USER-LIC，RNA鏈特異性建庫	Uracil-Specific Excision Reagent(1 U/μL)	14537ES
DNA損傷修復研究	Endonuclease VIII (10 U/μL)	14536ES
PCR防污染	Uracil DNA Glycosylase (UDG/UNG), 1 U/μL	14455ES

參考文獻

[1] Zhao S, Zhang Y, Gordon W, et al. Comparison of stranded and non-stranded RNA-seq transcriptome profiling and investigation of gene overlap. BMC Genomics. 2015 Sep 3;16(1):675. doi: 10.1186/s12864-015-1876-7.[2] Annaluru N, Muller H, Ramalingam S, Kandavelou K, London V, Richardson SM, Dymond JS, Cooper EM, Bader JS, Boeke JD, Chandrasegaran S. Assembling DNA fragments by USER fusion. Methods Mol Biol. 2012;852:77-95. doi: 10.1007/978-1-61779-564-0_7. PMID: 22328427.[3] Zhou J, Wang J, Chen F, Zhuang Z, Chen M, Yang Y, Luo X, Tang C, Zhou X, Chi Y, Wang J, He Y, Zhang K, Zou Q. Improved USER cloning for TALE assembly and its application to base editing. PLoS One. 2023 Aug 4;18(8):e0289509. doi: 10.1371/journal.pone.0289509. [4] Shi, ZX., Chen, ZC., Zhong, JY. et al. High-throughput and high-accuracy single-cell RNA isoform analysis using PacBio circular consensus sequencing. Nat Commun 14, 2631 (2023).

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