基本實驗步驟：

（1） 細胞準備。對單層生長細胞，在傳代培養時，將細胞接種到預先放置有處理過的蓋玻片的培養皿中，待細胞接近長成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次；對懸浮生長細胞，取對數生長細胞，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次，用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片。

（2） 固定。根據需要選擇適當的固定劑固定細胞。固定完畢后的細胞可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個月。PBS洗滌3×5 min.

（3） 通透。使用交聯劑（如多聚甲醛）固定后的細胞，一般需要在加入抗體孵育前，對細胞進行通透處理，以保證抗體能夠到達抗原部位。選擇通透劑應充分考慮抗原蛋白的性質。通透的時間一般在5-15min.通透后用PBS洗滌3×5 min.

（4） 封閉。使用封閉液對細胞進行封閉，時間一般為30min.

（5） 一抗結合。室溫孵育1h或者4℃過夜。PBST漂洗3次，每次沖洗5min.

（6） 二抗結合。間接免疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次沖洗5min后，再用蒸餾水漂洗一次。

（7） 封片及檢測。滴加封片劑一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。

（一）細胞準備

用于免疫熒光實驗的細胞可以是直接生長在蓋玻片上的貼壁細胞，也可以是經過離心后涂片的懸浮細胞或者是將取自體內的組織細胞懸液離心后涂片。貼壁良好的細胞一般在培養時直接放入coverslips讓細胞生長在其上即可，盡量避免使用貼壁性能不好的細胞進行免疫熒光實驗，以免后續的漂洗操作引起細胞脫落。少數實驗需要使用這類細胞或者懸浮細胞進行免疫熒光觀察，建議使用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片。

（二）固定和通透

除研究細胞表面抗原或不穩定抗原可不固定外，一般均應固定。固定的目的有三：

①防止細胞從玻片上脫落；

②除去防礙抗原-抗體結合的類脂；

③使標本易于保存。

標本的固定原則是：

①不能損傷細胞內的抗原；

②不能凝集蛋白質；

③應保持細胞和亞細胞結構；

④固定后應保持通透性，以保證抗體自由進入所有細胞與亞細胞組分與抗原結合。