流行性肥胖是近幾年的一大健康挑戰，肥胖促使一些心血管疾病如高血壓、血栓等發病率增高，糖尿病則是以高血糖為特征的代謝性疾病，長期存在可導致各種組織，特別是眼、腎、心臟、血管、神經的慢性損害、功能障礙。3T3-L1細胞——小鼠胚胎成纖維細胞（前脂肪細胞）系具有向脂肪細胞分化的特性，被廣泛用于研究糖尿病，肥胖癥等。 

(圖一）3T3-L1細胞形態 

（表一） 3T3-L1基礎培養信息

培養小提示：
1、 Never allow culture to become completely confluent.！！！細胞匯合度達到70-80%時進行傳代。
2、為了避免細胞聚團，在等待細胞消化的過程中，不要通過擊打或搖晃瓶子來刺激細胞。難以消化的細胞可以放置在37℃。
3、正常培養（非脂肪誘導期）出現空泡時，請優先考慮環境壓力。造成壓力的原因包括培養基中缺乏谷氨酰胺、添加抗真菌藥物、培養基中二氧化碳、碳酸氫鈉濃度不當或培養基的營養物質耗盡。
4、使用胎牛血清可能會造成細胞分化！！！  

3T3－L1成脂誘導“雞尾酒”策略 （圖二）3T3-L1細胞（正常）和3T3-L1成脂分化后（對照）

一般認為，細胞的增值和分化呈負相關，細胞開啟分化必先退出分裂增值周期，常用的方法就是讓其生長至融合期，出現接觸抑制。脂肪生成是一個將碳水化合物和其他底物轉化為脂肪酸，然后作為TAGs（甘油三酯）儲存起來的過程。
經典“雞尾酒”法中，胰島素樣生長因子（IGF-1）激活有絲分裂原蛋白激酶途徑誘導細胞分化、cAMP磷酸二酯酶抑制劑（IBMX）通過激活cAMP 依賴性蛋白激酶途徑增強 CCAAT/增強子結合蛋白家族 (C/EBPs)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ( PPARγ) 表達促進成脂分化、地塞米松促進C/EBPs的表達。

3T3－L1經典成脂誘導過程

誘導步驟：將融合后的3T3-L1（匯合度100%）細胞從DMEM生長培養基切換到含有0.5 mmol/L IBMX（abs817348）、10 mg/mL胰島素和1μmol/L地塞米松的分化培養基中48h。然后將細胞維持在含有10%FBS和10 mg/mL胰島素的DMEM培養基中48h，之后每隔一天更換常規新鮮培養基，一般第九天染色。

PS:不同產品活性純度不同，濃度僅供參考，不同誘導方案略有差異，IBMX（abs817348）用DMSO溶解時需要超聲破碎。

染色：油紅O儲存液與超純水按 3:2 稀釋混勻，過濾，避光靜置后酒紅色且無沉淀，現配現用,2h內用完。
用 PBS 磷酸緩沖液小心漂洗細胞三次，以2mL/孔（六孔板）的劑量加入4%多聚甲醛，室溫固定40min，再用蒸餾水漂洗2次，每孔加入油紅O工作液1mL，常溫染色15min，蒸餾水漂洗至無殘渣，蒸餾水漂洗后加入PBS鏡下觀察。

PS:清洗細胞時動搖要輕柔，防止脂滴脫落，油紅O工作液一定要過濾至無沉淀，否則染色后有殘渣且較難沖洗！！！

“雞尾酒”誘導策略進擊版
有研究者探索了葡萄糖濃度和誘導液2（含10mg/mL胰島素的低糖培養基）的作用時間對3T3L1細胞成脂分化率的影響，結果顯示，低糖培養基誘導時成熟脂肪細胞形成率明顯增高，誘導液2作用時間為3d時，成熟脂肪細胞形成率明顯高于其他組。 

注：文中圖片來源于網絡，僅供學習參考用

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參考文獻
[1]    Ling HY, Wen GB, Feng SD, Tuo QH, Ou HS, Yao CH, Zhu BY, Gao ZP, Zhang L, Liao DF. MicroRNA-375 promotes 3T3-L1 adipocyte differentiation through modulation of extracellular signal-regulated kinase signalling. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2011 Apr;38(4):239-46. doi: 10.1111/j.1440-1681.2011.05493.x. PMID: 21291493; PMCID: PMC3086632.
[2]    [1]張軼博,鐘悅,曾瑞霞.HAmLET誘導小鼠前脂肪細胞3T3-L1成脂分化[J].錦州醫科大學學報
[3]    [1]張曉琴. 優化3T3L1細胞成脂誘導模型并初步探討miR-222-3p對脂肪生成的作用[D].湖北中醫藥大學

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