1.所有凍干培養基、保護劑以及容器等均需高溫高壓滅菌。高壓滅菌前，在試管內貼上印有培養物標識的紙標簽。或者，使用帶無菌帽的試管。

2.取一環分離后所得到的細菌菌液或者是甘油保存的菌液，在細菌培養板上分區或者使用蛇形劃板，37℃倒置培養并過夜。
3.取一只干凈并且進行高溫高壓滅菌后的試管，倒入大約10ml的細菌培養液（大腸桿菌用磅培養液），從過夜培養后的培養平板中取一個單菌落至該培養液中后，在37℃溫度條件下振蕩培養過夜。
4.取10支清洗干凈且進行滅菌處理后的西林瓶，每個西林瓶中加入 1ml的凍干保護劑，后加入過夜培養后的1ml 菌液，蓋上無菌橡膠塞，備注：需要保留出氣孔，并做好標記后，存放于-80℃冰箱冷凍存儲。
5.細菌凍干機預熱約30分鐘后，迅速將已冷凍的菌液放在細菌凍干機上，打印幾小時至十幾小時不等細菌已凍干。
6.凍干后關閉凍干機，取出已經凍干好的細菌，壓蓋密封，存儲在 -80℃條件下超低溫冰箱保存，可存放數年。