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抗原蛋白 P9 ; 間接 ELISA

1 材料與方法

1. 1 菌株及血清 副雞禽桿菌 A、B、C 三個血清型

的標準株由本實驗室保存。Apg 的 A 型菌、B 型菌

和 C 型單因子雞血清和 P9 蛋白抗血清分別由對應

菌株或抗原人工接種 SPF 雞制得， 由本實驗室制備

并保存。大腸桿菌 O1、O2、O78亞型以及流感( AI)

H9 亞型、新城疫( ND) LaSota 株( NDLa) 和 F48 株

( NDf48) 、雞傳染性法氏囊病 ( IBD) 、減蛋綜合征

( EDS'76) 等禽病病原單因子陽性雞血清及 SPF 雞

血清等， 均由本實驗室保存或制備， 支原體抗 MG-S6

株陽性血清購自中國獸醫藥品監察所。120 份臨床

樣本血清采自河北某蛋雞場 120 日齡雞， 該雞群分

別在 56 日齡和 90 日齡用雞傳染性鼻炎三價滅活疫

苗進行了免疫。

紅細胞凝集反應用抗原( HA 抗原) : 副雞禽桿

菌 A 型( Hp8 株) 、B 型( BJ 株) 和 C 型( 668 株) HA

抗原， HA 效價均為 1∶ 160; 副雞禽桿菌 A 型陽性血

清、B 型陽性血清和 C 型陽性血清， 紅細胞凝集抑

制( HI) 抗體價為 1∶ 80 ～ 1∶ 160; 10% 戊二醛固定的

雞醛化紅細胞， 以及血清稀釋液( 含 0. 1% BSA 的

0. 01 mol /L pH 值 7. 0 PBS) ， 以上材料均由本實驗

室制備并保存。

1. 2 主要試劑和儀器 酶標板為 NUNC 公司產

品， HＲP 標記兔抗雞 IgG 抗體產自 Sigma 公司; TMB

顯色液產自 KPL 公司; 酶標儀( Molecular Devices，

SPECTＲA MAX190) 。

1. 3 方法

1. 3. 1 抗原蛋白 P9 的制備及純化 利用生物信息

學軟件 Geneious( Biomatters. Ltd，

， 通 過 對 副 雞 禽 桿 菌 外 膜 蛋 白

HMTp210 的基因( GenBank No． KJ867497) 篩選分

析， 選取氨基酸序列從第 1090 到 1648 的肽段， 命名

為 P9， 由華大基因科技( 北京) 服務有限公司進行全

基因合成并原核表達。通過對 P9 編碼基因的 PCＲ

擴增、與表達載體 pET30a 連接等步驟構建重組表

達 質 粒 pET30a-P9。 將 pET30a-P9 轉 化 BL21

( DE3) ， 誘導表達后超聲裂解上清用鎳親和層析柱

純化， 獲得純化的 P9 蛋白。

1. 3. 2 陰性血清及 P9 蛋白抗血清的制備 重組抗

原蛋白 P9 與 MONTANIDE ISA 71 VG 佐劑( SEPPIC

公司產品) 按 3 ∶ 7 重 量 比 混 合 乳 化 ( 操作方法見

SEPPIC 公司產品使用方法介紹) ， 使疫苗中抗原蛋

白終濃度為 20 μg /mL， 所制備的疫苗命名為 vP9。

免疫方法: 取 42 日齡 SPF 雞， 分為 2 組， 30 只 /組。

其中一組為疫苗免疫組， 分別胸部注射所述 vP9 疫

苗 0. 5 mL /只; 另一組為非免疫對照組。第 1 次免

疫后間隔 4 周， 對所有免疫組的雞進行二次免疫， 劑

量及免疫途徑與次免疫相同。所有試驗雞每周

于翅靜脈采血 1 次， 分離血清， － 20 ℃ 保存備用。

1. 3. 3 間接 ELISA 方法的建立

1. 3. 3. 1 抗原包被濃度及血清稀釋度的選擇 采

用棋盤滴定法， 用 0. 05 mol /L 碳酸鹽緩沖液( PBS，

pH 值 9. 6) 依次按以下比例稀釋 P9 抗原( 0. 5 mg /

mL) : 依次做 50、100、500、1 000、2 000、4 000、8 000、

16 000 倍稀釋， 包被反應板 100 μL /孔， 橫向包被酶

標板， 4 ℃ 過夜; PBST ( PBS + 1% tween20， pH 值

7. 4) 清洗 3 遍后加入封閉液 ( 5% 脫脂乳， PBS 配

制) ， 37 ℃ 封閉 2 h， PBST 清洗 3 遍。陽性血清及陰

性血清 分 別 用 稀 釋 液 ( 1% 脫脂乳， PBS 配制) 從

1∶ 50 進行倍比稀釋( 1∶ 50 ～ 1∶ 400) ， 100 μL /孔， 縱

向加入封閉后的抗原包被板中， 其余試驗步驟均按

ELISA 方法進行， 試驗結果標準副雞禽桿菌陽性血

清值 OD450 nm值為 1. 0 左右， 陰性 OD450 nm值設為 0. 1

左右的范圍選擇 P /N 值最大為最佳稀釋條件。

1. 3. 3. 2 最佳血清抗體孵育時間篩選 將血清用

稀釋液稀釋至相應濃度后加入抗原包被板， 100 μL /

孔， 分別 37 ℃ 孵育 0. 5 h、1 h、2 h， 其余試驗步驟均

按 ELISA 方法進行， 試驗結果選擇 P /N 值最大為最

佳孵育時間。

1. 3. 3. 3 酶標二抗最佳工作濃度及時間確定 完

成血清孵育并清洗后， 以稀釋液分別稀釋 HＲP 標記

兔抗雞 IgG 抗體至 1 ∶ 5 000、1 ∶ 10 000、1 ∶ 20 000，

100 μL /孔， 分別 37 ℃ 孵育 0. 5 h、1 h， 其余試驗步

驟均按 ELISA 方法進行， 試驗結果選擇 P /N 值最大

為最佳條件。

1. 3. 3. 4 顯色時間確定 酶標二抗孵育結束并清

洗后， 加入 TMB 顯色液， 100 μL /孔， 放置于 37 ℃ 孵

育 5、10、15、20 min 后加入 2 mol /L H2 SO4 終止讀

數， 50 μL /孔。選擇 P /N 值最大時最佳顯色時間。

1. 3. 4 臨界值的確定 在優化間接 ELISA 的最佳

條件后， 使用該方法對 30 份陰性血清進行檢測， 根

據檢測樣品的 OD450 nm 值平均值和標準差設定該間

接 ELISA 方法的判定值: !X + 3 s; 待檢樣品 的

OD

450 nm值若大于判定值， 則該樣品為陽性， 反之， 則

判為陰性。

1. 3. 5 交叉反應性試驗 采用標記為 Hp8( A 型) 、

0221( A 型) 、0083( A 型) 、0222( B 型) 、BJ( B 型) 、

668( C 型) 、Modesto( C 型) 等不同血清型副雞禽桿

菌分別單獨感染的雞血清作為待測陽性血清， 未經

免疫的 SPF 雞血清為陰性血清， 各個血清樣本做 3

個平行重復測試， 用于評價本方法的交叉反應性。

1. 3. 6 特異性檢驗 應用已建立的間接 ELISA 方

法， 對常見的大腸桿菌 O1、O2、O78 株， 流感( AI)

H9 亞型、新城疫 ( ND) LaSota 株 ( NDla) 和 F48 株

( NDf48) 、減蛋綜合征( EDS'76) 、雞毒支原體 MG-S6

等禽病病原的陽性血清進行檢測， 并以標準副雞禽

桿菌陽性血清為陽性對照， 測定 OD450 nm 值， 各個血

清樣本做 3 個平行重復測試， 確定該方法的特異性。

1. 3. 7 ELISA 方法檢測田間血清樣品 本試驗建

立的 ELISA 方法， 對所收集的臨床免疫雞血清， 進

行測定。各個血清樣本做 3 個平行重復， 計算 OD

值， 并依照本試驗所設標準判定檢測結果。

1. 3. 8 ELISA 方法與 HI 試驗 實驗室收集的 120

份臨床樣品用 HI 試驗進行對比試驗， 分別用 3 個血

清型的 HA 抗原進行檢測， 方法如下［7］ : 用血清稀釋

液將吸附后的血清作 2 倍系列稀釋， 第 1 孔為 1∶ 5，

第 2 孔為 1∶ 10， 依此類推， 共作 8 個稀釋度( 1∶ 5，

1∶ 10， 1∶ 20， …， 1∶ 640) ， 每孔含有 50 μL 稀釋血清。

在各管中加入 4 個 HA 單位的 HA 抗原 50 μL， 充分

混勻后在室溫作用 20 min， 然后每管加入 1% 雞紅細

胞 50 μL， 充分混勻后在室溫靜置 60 min， 判定結

果， 以全抑制 HA 的血清最高稀釋度為血清的 HI

效價。若試驗血清的 HI 效價≥5， 即判為陽性。

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