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5mC在DNA和RNA中的精確位置和化學計量對其生物功能和臨床應用至關重要。因為5mC作為基因表達的關鍵調控因子，在染色質結構、DNA穩定性和蛋白質互作中扮演重要角色。此外，5mC是表觀遺傳學的重要標記，對研究生物體發育、疾病和進化有深遠意義。異常5mC修飾與多種疾病相關，其精確檢測有助于疾病的早期診斷、預后評估和治療策略制定。同時，5mC檢測對新藥研發也至關重要，有助于篩選特定作用機制的藥物候選物。因此，準確快速地檢測5mC的位置和化學計量是深入了解其生物功能、推動臨床應用和促進新藥研發的關鍵。

▲BS轉化流程示意圖

目前，針對5mC的測序，主要有全基因組重亞硫酸鹽甲基化測序（BS-seq）和精準DNA甲基化與羥甲基化測序（oxBS-seq）。BS-seq被譽為DNA甲基化研究的金標準，因為它能在全基因組范圍內準確檢測每個胞嘧啶堿基的甲基化水平。這種方法不僅重復性好、價格適中，而且應用廣泛，能夠獲取全基因組的完整甲基化信息，并精確分析每個C堿基的甲基化狀態。

然而，BS-seq的一個主要限制是它無法區分DNA甲基化和羥甲基化。該方法依賴于將單鏈DNA中未甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶，因此雙鏈DNA（dsDNA）的變性至關重要，否則可能導致高背景或假陽性結果。此外，轉化過程需要較長時間和較高溫度，這在一定程度上限制了其在臨床快速檢測中的應用，并可能導致DNA損傷和降解。

相比之下，精準DNA甲基化和羥甲基化測序采用了化學氧化法與重亞硫酸鹽轉化相結合的技術，能夠精確檢測DNA甲基化并排除羥甲基化的干擾。這種方法甚至可以通過雙文庫結合同時分辨單個堿基的甲基化和羥甲基化狀態，從而解決了常規方法無法區分這兩種修飾的問題。但這種方法也存在一些缺點，如技術復雜、成本高、對樣本質量要求高以及數據解讀具有挑戰性等。此外，它可能無法覆蓋基因組的所有區域，并可能受到PCR偏倚的影響。

▲ oxBS-seq 5mC單堿基分辨率測序

除了DNA外，5mC還存在于多種RNA分子中，包括rRNA、tRNA、mRNA以及各種非編碼RNA。雖然商用試劑盒的BS-seq可以方便地應用于檢測豐富RNA（如tRNA和rRNA）中的5mC，但某些RNA的結構特性可能阻礙其準確定量。當將傳統BS-seq應用于低豐度RNA（如mRNA）時，可能會發現較大的差異。

綜上所述，開發出低成本的快速精準檢測微量DNA與RNA中的5-甲基胞嘧啶的新方法，對其基礎研究及臨床應用至關重要。基于此，2024年3月21日 20：15-21：15，醫麥客將攜手翌圣生物，以“甲基化研究技術進展及應用”為主題，分析現有5-甲基胞嘧啶的測序方法及其優缺點，探討下一代超快速精準檢測微量DNA與RNA中5-甲基胞嘧啶的新方法，屆時歡迎各位在線交流學習！