EnGen SpRY Cas9 核酸酶是來(lái)自 S. pyogenes的 Cas9 核酸酶的變體，其 PAM 作用結(jié)構(gòu)域內(nèi)有幾個(gè)點(diǎn)突變（1）。與野生型 Cas9 不同，EnGen SpRY Cas9 不受 NGG PAM 的限制，在體外應(yīng)用中可以在任意三核苷酸序列上游進(jìn)行雙鏈切割。

EnGen® SpRY Cas9 切割靈活性的演示。A）pXba 的示意圖，顯示了限制性?xún)?nèi)切酶 BsrGI 識(shí)別位點(diǎn)。矩形框中包含了 BsrGI 識(shí)別序列，紅色三角形表示切割位點(diǎn)。B）用于靶向 pXba 中 BsrGI 位點(diǎn)的三個(gè) sgRNA 序列。EnGen SpRY Cas9 和 BsrGI 的切割位點(diǎn)均以紅色三角指示。SpRY Cas9 非經(jīng)典 PAMs 以黃色文本表示。C）在 1X NEBuffer r3.1 中，使用 10 units BsrGI 或 1µM EnGen SpRY Cas9 和上述三種 sgRNA（濃度均為1µM）消化 1µg pXba 質(zhì)粒（22563 bp）。所有反應(yīng)在 37°C下溫育 1 小時(shí)，然后在 80°C下溫育 5 分鐘。通過(guò)使用 Agilent gDNA ScreenTape 系統(tǒng)在 4200 TapeStation 儀器上進(jìn)行凝膠電泳，以比較 BsrGI 和 SpRY 消化后產(chǎn)物 DNA 條帶。針對(duì) pXba 質(zhì)粒的 BsrGI 位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)切割， BsrGI 和 SpRYCas9 切割產(chǎn)生了幾乎一致的條帶圖譜。使用濃度低至 50 nM 的 EnGen SpRY Cas9 和 sgRNA對(duì) 1µg pXba 質(zhì)粒進(jìn)行消化，結(jié)果與濃度 1 µM 的相似。未酶切的 pXba 作為對(duì)照進(jìn)行電泳，但是環(huán)狀 DNA 在 gDNA ScreenTape 系統(tǒng)中電泳不能精確地按大小進(jìn)行分離。

在 1X NEBuffer™ r3.1 中，使用 50 nM 的 EnGen SpRY Cas9 和 50 nM 的 sgRNA，在37°C下反應(yīng) 1 小時(shí)，將 1 µg pXba（22,563 bp）在 pVII ORF 起始密碼子的下游進(jìn)行線性化。在繼續(xù) DNA 組裝之前，線性化質(zhì)粒可以選擇經(jīng)過(guò)柱純化或不純化。按照推薦方案，使用 NEBuilder 高保真 DNA 組裝試劑盒將編碼核定位信號(hào)（NLS）標(biāo)簽的寡核苷酸插入到pVII中。通過(guò)轉(zhuǎn)化后生長(zhǎng)的克隆數(shù)量，可以定性評(píng)估在 EnGen SpRY Cas9 消化質(zhì)粒后，有多少轉(zhuǎn)化子來(lái)自未消化的質(zhì)粒。雖然不是必需的，但在組裝前對(duì)線性化的 pXba 質(zhì)粒進(jìn)行純化可以減少背景菌落百分比。