ELISA技術原理將抗原抗體的特異性免疫反應與酶的催化反應相結合的免疫檢測技術，利用酶標技術標記抗原或抗體，通過顯色反應，用以檢測相應的抗體或抗原，對其進行定性或定量分析。

ELISA實驗以靈敏度較高、特異性較好的特點得到了廣泛的應用，但操作中的各個環節對試驗的檢測效果影響較大，如不注意，有可能導致顯色不全、花板等結果。下面一步步分析ELISA試驗操作中可能影響結果因素。

1、標本的選擇與準備

      用于ELISA測定的臨床標本最為常用的是血清(漿)，有時因為特定的檢測目的，也用到唾液、腦脊液、尿液、糞便等標本。目前臨床上使用血清標本測定的標志物一般有傳染性病原體的抗原和抗體、腫瘤標志物、激素、特種蛋白、細胞因子和治療藥物等。對用于激素和治療藥物測定的血清標本的收集，要注意收集時間甚或體位有可能會對測定結果產生影響。如可的松在早晨4～6點之間，會有一峰值出現：生長激素、促黃體激素(LH)和促卵泡激素(FSH)均以陣發性方式釋放，因此，在測定此類激素時，有必要在密切相連的時間間隔內采取數份血樣本，以其中間值為測定值。又如當從臥位變為站立位時，血清中腎素活性將出現明顯增高。再如治療藥物的檢測，應根據藥代動力學選擇服藥后的最適時間抽血檢測。用于傳染性病原體的抗原和抗體、腫瘤標志物和特種蛋白等的檢測的血清標本的收集則沒有時間和體位方面的影響，只是在處理和保存方面要考慮以下幾個方面：

       (1)、要注意避免出現嚴重溶血。血紅蛋白中含有血紅素基團，其有類似過氧化物的活性，因此，在以HRP為標記酶的ELISA測定中，如血清標本中血紅蛋白濃度較高，則其就很容易在溫育過程中吸附于固相，從而與后面加入的HRP底物反應顯色。

      (2)、樣本的采集及血清分離中要注意盡量避免細菌污染，一則細菌的生長，其所分泌的一些酶可能會對抗原抗體等蛋白產生分解作用;二則一些細菌的內源性酶如大腸桿菌的β-半乳糖苷酶本身會對用相應酶作標記的測定方法產生非特異性干擾。

      (3)、血清標本如是以無菌操作分離，則可以在2～8℃下保存一周，如為有菌操作，則建議冰凍保存。樣本的長時間保存，應在-70℃以下。

      (4)、冰凍保存的血清標本須注意避免因停電等造成的反復凍融。標本的反復凍融所產生的機械剪切力將對標本中的蛋白等分子產生破壞作用，從而引起假陰性結果。此外，凍融標本的混勻亦應注意，不要進行劇烈振蕩，反復顛倒混勻即可。

      (5)、標本在保存中如出現細菌污染所致的混濁或絮狀物時，應離心沉淀后取上清檢測。

2、試劑的準備

      在實驗室，對試劑準備一般不太注意，通常的做法是，在實驗時將試劑從冰箱中拿出來即用，而忽略了這種做法有可能影響后面溫育時間不夠的問題，其直接的后果是對一些弱陽性標本的檢測出現假陰性。因此在ELISA測定中試劑的準備最為關鍵的是，在實驗開始前，將試劑盒先從冰箱中拿出來，在室溫下放置30-60分鐘，再進行測定，以使試劑盒在使用前與室溫平衡。這樣做的目的，主要是為了在后面的溫育反應步驟中，能使反應微孔內的溫度能較快地達到所要求的高度，以滿足測定要求。

3、加樣

      （1）、標本為血清：最好將血液先自然存放1-2小時后，再用3000rmp離心15分鐘;標本為血漿：必須使用含抗凝劑的血液標本收集管，采血后必須立即顛倒采血管混合5-10次，放置一段時間后，3000rpm離心15分鐘;若在幾天內檢測，可放在2-8℃冰箱中，若要貯存，則置于-20℃的低溫冰箱內。

      （2）、加樣后及時放入孵箱。 

      （3）、加酶試劑后用吸水紙在酶標板表面輕拭吸干。

      （4）、如果采用AT或其他全自動加樣，最好選擇FAME或其他后處理儀器加酶試劑。 

      （5）、標本較多時，請分批操作。

      （6）、血清樣本的加入幾乎是唯1的要使用微量加樣器加入樣本的步驟。使用微量加樣器加樣必須注意的關鍵點是：加樣不可太快，要避免加在孔壁上部，不可濺出和產生氣泡。加樣太快，無法保證微量加樣的準確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區，易導致非特異吸附。濺出會對鄰近孔產生污染。出現氣泡則反應液界面有差異。

4、孵育

      （1）、溫育是ELISA測定中影響測定成敗最為關鍵的一個因素。ELISA作為一種固相免疫測定，抗原抗體的結合反應在固相上進行，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原全結合，必須在一定的溫度條件下反應一定的時間。溫育所需時間與溫度成反比，即溫度越高，則所需時間相對較短。最為常用的溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2～8℃。按照操作說明嚴格控制孵育時間；

      （2）、孵育時貼封片或加蓋，避免標本或稀釋液蒸發，吸附于孔壁。

5、洗板

       保證洗液注滿各孔，洗板針暢通，洗完板后最好在吸水紙(選擇干凈、無或少塵的吸水材料)上輕輕拍干;反應板過多時，合理安排，或多用幾臺洗板機，避免等待時間過長。

6、 顯色

      顯色劑盡量在臨用前配制，堅持不用過期顯色劑，肉眼可見淺藍色的TMB顯色劑不用; 加樣時保持顯色劑不外流。

7、 終止

      在加終止液時應避免產生氣泡，而導致假陽性結果。

8、讀板

      整個操作過程中保證酶標板不接觸次氯酸;盡可能實現ELISA檢測標準自動化，有效提高檢測質量。

      在實際操作中，除了選擇優良試劑外，必須嚴格按照操作步驟進行操作，同時作好室內質控、室間質評，以嚴謹的工作作風檢測每一份標本，才能保證檢測質量。