細(xì)胞凍存實(shí)驗(yàn)用于保護(hù)細(xì)胞免受損傷，以便在需要的時(shí)候重新復(fù)蘇和使用，對(duì)于保存少有的細(xì)胞資源、制備細(xì)胞庫(kù)、研究細(xì)胞生物學(xué)等方面具有重要意義。

實(shí)驗(yàn)步驟：

1.細(xì)胞凍存液提前配置：凍存液配置比例根據(jù)實(shí)驗(yàn)習(xí)慣即可，若細(xì)胞不多或使用人數(shù)較少，建議一次少量配置，配置完成后，由于DMSO的存在，因此需要嚴(yán)格避光保存。

2.需要凍存的細(xì)胞密度要求≥90%，鏡下觀察細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞密度滿足要求后，棄掉原有培養(yǎng)基，沿培養(yǎng)皿邊緣加入1ml溫浴的PBS緩沖液清洗。

3.棄掉PBS緩沖液，加入胰酶消化細(xì)胞，消化時(shí)間根據(jù)細(xì)胞類型決定。

4.消化到時(shí)間后，加入二倍胰酶體積的培養(yǎng)基終止消化，用移液器將細(xì)胞全部吹下，轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)。

5.離心機(jī)常溫800rpm，離心5min。

6.棄上清，加入1ml配置好的凍存液，用移液器輕輕吹打10-15次混勻。

7.凍存管標(biāo)記好相應(yīng)信息，包括細(xì)胞名稱、代數(shù)、凍存時(shí)間、操作者姓名等，將上述混懸液全部轉(zhuǎn)移至凍存管內(nèi)，擰緊凍存管管口，放入程序降溫盒內(nèi)。

8.將程序降溫盒放入-80℃冰箱內(nèi)，36h后可從程序降溫盒內(nèi)拿出細(xì)胞放在細(xì)胞凍存架上保存。

常見(jiàn)問(wèn)題

1.細(xì)胞凍存管具體存放方式、溫度、時(shí)間等由實(shí)驗(yàn)室條件決定，我所述只是我實(shí)驗(yàn)過(guò)程中凍存細(xì)胞的保存方法。

2.關(guān)于凍存液的配置，我實(shí)驗(yàn)所用配方為培養(yǎng)基：血清：DMSO =7：2：1，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中凍存的細(xì)胞復(fù)蘇狀態(tài)良好。

注意事項(xiàng)

1.在凍存管上標(biāo)記信息時(shí)使用一支質(zhì)量較好的馬克筆，保證在后期進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)信息不會(huì)被水或酒精洗掉。

2.細(xì)胞凍存時(shí)應(yīng)保證細(xì)胞狀良好，無(wú)污染。

3.細(xì)胞凍存原則為“慢凍”，因此，細(xì)胞加入凍存管后如何保存應(yīng)嚴(yán)格遵守凍存流程，避免凍存太快，產(chǎn)生結(jié)晶。

4.二甲基亞砜（DMSO）是一種細(xì)胞保護(hù)劑，在深低溫情況下可防止細(xì)胞內(nèi)形成冰晶，減少細(xì)胞損傷，因此凍存液配置中DMSO是不能少的，但可以改變血清的比例，對(duì)于一些原代細(xì)胞或較為重要的細(xì)胞，可將血清比例提高至50%-90%，保證其有較高的存活率。

5.細(xì)胞凍存后再進(jìn)行復(fù)蘇時(shí)，細(xì)胞數(shù)量不可避免會(huì)減少，因此，在凍存前，細(xì)胞量要足夠多，密度≥90%。

6.細(xì)胞混懸液加入凍存管后，不宜在常溫放置過(guò)久，因此應(yīng)先將細(xì)胞凍存盒放入冰箱，再進(jìn)行后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

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