DNA甲基化修飾在維持正常細胞功能、基因組結構穩定、遺傳印記、胚胎發育、及腫瘤和疾病的發生、發展起關鍵作用。5mC可以導致基因沉默或基因表達水平降低，而5hmC則會導致基因激活或基因表達水平增高，研究表明腫瘤抑癌基因的過甲基化或原癌基因的低甲基化在多種腫瘤中被發現。因此，分析基因組的甲基化水平具有重要的臨床意義。

隨著分子檢測的不斷發展，甲基化qPCR檢測以及甲基化NGS檢測已成為非常普及的檢測技術，這兩種技術的必經之路就是甲基化轉化，甲基化轉化從方法學上可分為亞硫酸氫鹽轉化和酶法轉化，近幾年，基于DNA甲基化位點的檢測試劑盒陸續獲批面世。NMPA批準的甲基化檢測試劑盒大部分為熒光PCR法，主要原因在于熒光PCR法操作簡便，無需在PCR后電泳，且具有靈敏度高、特異性強、重復性好等特點。這些甲基化檢測試劑采用的轉化方法為亞硫酸氫鹽轉化法，亞硫酸氫鹽轉化成為DNA甲基化檢測的“金標準”。但是傳統的亞硫酸氫鹽轉化有很多局限性，例如過長的轉化時間、嚴重的DNA損傷、被高估的5mC水平、C-U轉化不全等。

圖1.亞硫酸氫鹽催化C轉化為U的化學反應概要

2024年1月2日，芝加哥大學何川教授團隊在Nature Biotechnology上在線發表了題為Ultrafast bisulfite sequencing detection of 5?methylcytosine in DNA and RNA的研究論文，該研究提出并開發了對DNA和RNA上的5-甲基胞嘧啶修飾進行快速，準確檢測的測序方法，簡稱為UBS-seq。該技術比現有的轉化反應過程加速20-30倍，同時明顯的降低了DNA損傷，以及C-U轉化導致的背景干擾。

圖2.UBS-seq法在微量樣本中應用，傳統BS轉化相比有更低的背景噪音

翌圣生物的Hieff® Superfast DNA Methylation Bisulfite Kit便是基于此技術開發優化而成，可以在98°C 5min條件下可完成＞99.5%的胞嘧啶轉化，并且極大的降低了DNA損傷，更好的保證了DNA片段的完整性。

圖3.Superfast DNA Methylation Bisulfite的技術原理及優勢

Hieff® Superfast DNA Methylation Bisulfite Kit（12225ES）將DNA變性與亞硫酸氫鹽轉化融合為一步，5分鐘內即可完成轉化，約30 min可完成BS轉化全流程。采用柱內脫硫技術，使操作流程更為簡單；可以滿足100 pg-2 μg樣品的轉化；未甲基化胞嘧啶轉化為尿嘧啶的轉化率≥99%；轉化后的產物適用于PCR擴增和DNA測序等下游應用。

圖4.Superfast BS轉化實驗流程

使用12225與競品A和競品B轉化試劑盒進行頭對頭對比，轉化樣本為200 ng和2 μg的FFPE DNA，FFPE DNA中參入1% λ DNA，轉化后的樣本采用甲基化單鏈DNA建庫（12221ES），如圖5所示：12225對不同投入量的FFPE DNA中 λ DNA C的轉化率＞99.5%。

使用12225與競品B和競品C轉化試劑盒進行頭對頭對比，300 ng樣本為不含甲基化 λ DNA，800ng樣本為人基因組DNA，轉化后采用Qubit ssDNA定量，洗脫體積均為30 μL，轉化后的產物采用甲基化轉化特異性引物探針PCR，片段大小為286bp，擴增產物采用瓊脂糖凝膠電泳，如圖6所示：12225的樣本回收率優于競品B和競品C，且轉化后的甲基化特異性引物擴增效果 優。

圖6.12225和競品的回收率

使用12225和競品A轉化試劑盒分別對gDNA樣本進行轉化，轉化后使用甲基化單鏈建庫試劑盒（12221ES）建庫，文庫產量和質控數據如圖6所示：12225和競品A轉化后相同的文庫pooling測序，12225下機數據量更多，ontarget_ratio(%)更高，Dup(%)更低。

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