實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是一種在DNA擴增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內(nèi)參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法。

實時熒光定量PCR工作原理：此次介紹熒光染料法，目前常用的熒光染料是SYBR Green I，是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料，在游離狀態(tài)下，SYBR Green I發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光大大增強。因此SYBR Green I的熒光信號強度與雙鏈DNA的數(shù)量相關(guān)，可以根據(jù)熒光信號檢測出PCR體系存在的雙鏈DNA數(shù)量。

在學(xué)習(xí)實時定量PCR數(shù)據(jù)處理之前，我們首先需要了解一下它的數(shù)學(xué)原理，Ct值為什么是我們數(shù)據(jù)處理過程中的一個關(guān)鍵的因素。這兩個圖顯示的是實時定量PCR的一組結(jié)果。上圖是原始的線性圖譜，下圖則是處理過的指數(shù)圖譜，但是它們兩者表示的是同樣的意思。x-軸表示PCR 循環(huán)數(shù)，y-軸表示擴增反應(yīng)的熒光值，也就是擴增產(chǎn)物的量。這個圖中有基線、閾值、Ct值這幾個概念，從這幾個值我們能夠最終得到模板中目的基因的含量。

（1）那么什么是基線？如紅色框所指，基線就是擴增曲線中的水平部分。在反應(yīng)最初階段，雖然產(chǎn)物是指數(shù)級增長，但是由于總量太少，其熒光處于背景水平，檢測不到熒光增加。因此基線信號的產(chǎn)生是由于測量的偶然誤差引起的。然而當(dāng)累積了足夠的擴增產(chǎn)物，足以產(chǎn)生可檢測的熒光信號時，這個信號的值就被稱為閾值，如紅色箭頭所指。通常閾值默認(rèn)為基線信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差×10。在閾值的前后，PCR的反應(yīng)仍然是指數(shù)級增長的，因此此時的PCR結(jié)果可靠，可以準(zhǔn)確地反映體系中模板的初始量。Ct值是信號強度達(dá)到閾值時所需要的循環(huán)數(shù)，也就是擴增曲線與閾值的交叉點，如圖中的紅點所指。

（2）我們可以看到圖的右邊顯示了擴增曲線的4個階段：基線期、指數(shù)增長期、線性增長期和平臺期。其中在基線期和指數(shù)增長期，擴增產(chǎn)物都是以指數(shù)級增長的，但是在基線期我們沒有辦法檢測；而到了線性期和平臺期之后，由于不同基因，或者不同條件下其擴增效率差別很大，因此沒有辦法計算模板的含量。因此，在指數(shù)增長期的Ct值就成為了計算模板含量的一個關(guān)鍵值。

（3）那么，為什么知道了Ct值就能夠得到最初的目的基因含量呢？圖中表示一個基因的單次反應(yīng)擴增曲線。上面這個公式計算的是擴增產(chǎn)物的分子數(shù)N，它等于模板的分子數(shù)乘以1+擴增效率的n次方，n代表循環(huán)次數(shù)。也就是說，如果擴增效率為100%，產(chǎn)物分子數(shù)就等于模板數(shù)乘以2的n次方。但是顯然，在線性增長期和平臺期，擴增效率不可能是100%，因此上述PCR理論方程只在指數(shù)期成立，也就是綠色框的部分。