遺傳霉素（Geneticin，G418）是一種氨基糖苷類抗生素，它通過與原核和真核細(xì)胞的70S和80S核糖體結(jié)合，阻斷肽鏈延伸，從而抑制蛋白質(zhì)合成。這一機(jī)制對包括細(xì)菌、酵母、植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等都有毒性。當(dāng)細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染并整合含有新霉素抗性基因（如neo基因）后，該基因編碼的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶（APH(3)II）能夠共價(jià)修飾G418，使其失活，從而賦予細(xì)胞在含有G418的選擇性培養(yǎng)基中生長的抗性。

在分子遺傳試驗(yàn)中，G418是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染常用的抗性篩選試劑之一。

G418通過抑制蛋白合成，用于篩選含有抗性基因（如neo基因）的細(xì)胞。抗性基因編碼的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶能使G418失活，從而賦予細(xì)胞對G418的抗性。通常情況，哺乳動(dòng)物細(xì)胞篩選范圍是200-2000 μg/mL，常用的工作濃度為100-700 μg/mL。其中植物細(xì)胞是10-100 μg/mL；酵母細(xì)胞是500-1000 μg/mL，以下是一些細(xì)胞類型使用G418篩選使用的濃度，可做參考。

在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，G418用于篩選能夠抵抗該抗生素的細(xì)胞，這些細(xì)胞通常攜帶有特定的抗性基因。

1）活力單位的換算
根據(jù)此公式進(jìn)行換算：（1000/A0）×A1=A2，其中A0是G418的活力值（Potency），因批次而異。可見批次對應(yīng)的質(zhì)檢報(bào)告，或者瓶子上的標(biāo)簽。A1是想配制的活性G418濃度。A2是實(shí)際稱重的粉末與體積比濃度。
比如若所用批次的G418 活力值為：750 U/mg，要配制50 mg/mL的G418活性濃度，則實(shí)際要配制的粉末濃度為1000/750×50 mg/mL=66.67 mg/mL。
如果配制10 mL的G418儲(chǔ)存液（活性濃度，50 mg/mL），則需要稱取666.7 mg粉末。
2）除菌和保存
根據(jù)上述換算得到的實(shí)際粉末稱重量，加入10 mL無菌去離子水內(nèi)使其溶解。
先用5 mL無菌去離子水預(yù)濕潤0.22 μm針頭式過濾器，除盡水。之后使用此濾器過濾，除菌后分裝成單次使用的小量（如1mL）放到-20℃凍存，1年穩(wěn)定。

1) 第一天：未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞按照20-25%的細(xì)胞密度鋪在合適的培養(yǎng)板上，37℃，CO2培養(yǎng)過夜；
2) 根據(jù)細(xì)胞類型，設(shè)定合適范圍內(nèi)的濃度梯度，至少選擇6個(gè)濃度（處理分裂期的細(xì)胞時(shí)G418的活性強(qiáng)，因此在添加G418之前需要讓細(xì)胞培養(yǎng)一段時(shí)間），以哺乳動(dòng)物細(xì)胞為例，可設(shè)定0，50，100，200，400，800，1000 μg/mL。
3) 第二天：去除舊的培養(yǎng)基，換用新鮮配制的含有相應(yīng)濃度藥物的培養(yǎng)基，每個(gè)濃度做三個(gè)平行孔。
4) 接下來每3-4天更換新的含藥物培養(yǎng)基。
5) 按照固定的周期（如每2天）進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)來確定阻止未轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長的恰當(dāng)濃度。選擇在理想的天數(shù)（通常是7-10天）內(nèi)能夠殺死絕大多數(shù)細(xì)胞的濃度為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選用的工作濃度。

1）轉(zhuǎn)染48 h后，用含有適當(dāng)濃度的G418篩選培養(yǎng)基來傳代細(xì)胞（直接傳代或者稀釋后傳代）。

2）每隔3-4天更換含有藥物的篩選培養(yǎng)液。

3）篩選7天后觀察并評估細(xì)胞克隆（集落）的形成情況。集落的形成可能還需要一周或者更多的時(shí)間，這取決于宿主細(xì)胞類型，轉(zhuǎn)染以及篩選效果。

4）挑取并轉(zhuǎn)移5-10個(gè)抗性克隆于35 mm細(xì)胞培養(yǎng)板，繼續(xù)用含藥物的篩選培養(yǎng)液維持培養(yǎng)7天。

5）之后更換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)即可。

產(chǎn)品推薦

翌圣生物提供的G418 遺傳霉素（60220ES）效力≥720 U/mg，純度~98%，且批次穩(wěn)定，與其他公司的G418產(chǎn)品相比，價(jià)格近1/3。

以大腸桿菌為實(shí)驗(yàn)對象，G69和G99是兩個(gè)不同的批次；基因組霉素的使用濃度分別為8 mg/L、12 mg/L和16 mg/L，有效最小濃度為16 mg/L，抑制了雜菌的生長。

圖1.不同批次間基因組霉素有效濃度的穩(wěn)定性試驗(yàn)和驗(yàn)證

注意事項(xiàng)

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