一、原理

　　PCR技術(shù)的本質(zhì)是體外核酸擴增，加熱使雙鏈DNA解開螺旋，在退火溫度條件下引物同模板DNA雜交，在Taq DNA聚合酶，dNTPs，Mg2+和合適pH緩沖液存在條件下延伸引物，重復 “變性→退火→引物延伸”過程至25～40個循環(huán)，呈指數(shù)級擴大待測樣本中的核酸拷貝數(shù)。

二、分類

1. 普通的PCR儀

　　一次PCR擴增只能運行一個特定退火溫度的PCR儀，又叫傳統(tǒng)的PCR儀。

　　用途：主要是做一些簡單的、對單一退火溫度的目的基因進行擴增。

　　（1）梯度PCR儀： 一次PCR擴增可以設(shè)置一系列不同的退火溫度條件(溫度梯度)，通常為12種溫度梯度的普通PCR儀。

　　用途：研究未知DNA退火溫度的擴增。

　　（2）原位PCR：將具有細胞定位能力的原位雜交技術(shù)運用于從細胞內(nèi)靶DNA的定位分析，在細胞內(nèi)實現(xiàn)基因擴增的普通PCR儀。

　　用途：用于在細胞的靶DNA所在位置上進行基因擴增。

2. 實時熒光定量PCR儀

　　PCR擴增時加入的引物利用熒光素進行標記，使引物和熒光探針同時與模板進行特異性結(jié)合，擴增結(jié)果通過熒光信號采集系統(tǒng)實時采集信號并輸送到計算機分析處理系統(tǒng)，實時輸出量化結(jié)果，這樣的PCR儀叫實時熒光定量PCR儀。

　　（1）金屬板式實時定量PCR儀

　　可作為普通PCR儀使用

　　可帶梯度功能

　　可容納的樣本量大，無需特殊耗材

　　溫度均一性欠佳，有邊緣效應，標準曲線的反應條件難以做到與樣品全一致

　　（2）離心式實時定量PCR儀

　　溫度均一性較好

　　使用的是同一個激發(fā)光源和檢測器，隨時檢測旋轉(zhuǎn)到跟前的樣品，有效減少系統(tǒng)誤差

　　可容納樣品量少，有的需用特殊毛細管作樣品管，增加了使用成本，也不帶梯度功能

　　（3）各孔獨立控溫的定量PCR儀

　　不同樣品槽分別擁有獨立的智能升降溫模塊，各孔獨立控溫，適合多指標快速檢測。

　　SmartCyclerⅡ的軟件允許一臺儀器同時操作六個樣品模塊，既滿足高速批量要求，又能靈活運用，還可實現(xiàn)任意梯度反應。

　　SmartCyclerⅡ上樣不如傳統(tǒng)方法方便，而且需要有的扁平反應管，使用成本較高。

三、操作規(guī)程

　　普通PCR擴增儀的操作非常簡便，接通電源，儀器自檢，設(shè)置溫度程序或調(diào)出儲存的程序運行即可。

　　定量PCR擴增儀的操作和普通PCR儀基本相同。

四、常見故障

　　①熒光染料污染樣品孔；

　　②PCR管融化，原因可能是溫度傳感器出問題或是熱蓋出問題；

　　③個別孔擴增效率差異很大，可能的原因是半導體模塊出現(xiàn)壞點；

　　④熒光強度減弱或不穩(wěn)定，產(chǎn)生的原因有濾光片發(fā)霉或有水汽，或光源損耗（以鹵鎢燈為光源的），需更換光源；或需調(diào)節(jié)檢測元件靈敏度；

　　⑤儀器工作時出現(xiàn)噪音。

　　以上故障部分可自行檢查，部分需工程師檢修。