載體酶切位點

（如果為反向PCR，可不填）

片段含同源臂的引物序列

可通過翌圣無縫克隆引物設計軟件    進行引物設計

線性化載體純化方式

片段純化方式

載體濃度

     ng/μL

片段濃度

     ng/μL

載體投入體積

     μL

片段投入體積

     μL

推薦翌圣—支持中心—生物計算器—克隆連接投入量計算板塊，輸入片段數、濃度、大小，即可獲得投入量： 

反應條件

溫度     ℃、時間       min

感受態轉化步驟

如：小翌的快速感受態細胞

1、提前15 min將LB平板放到37℃培養基中預熱。

2、將F-DH5α感受態細胞（DH5α Fast Chemically Competent Cell，Cat#11803ES）從-80℃拿出迅速插入冰上，待菌體融化，加入目的DNA（質粒或連接產物），輕輕彈勻，冰浴靜置5 min。

3、用200 μL移液槍將上一步的混合物轉移到已經37℃預熱的LB培養基上，均勻涂布。

4、將平板置于37℃培養箱倒置過夜培養。若進行藍白斑篩選操作，平板在37℃至少倒置培養15 h。

挑單菌落

用無菌的槍頭或牙簽將單個菌落挑至新一代快速菌落PCR Mix中混勻（2×Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR Master Mix，Cat#10167ES），加入引物直接進行PCR反應。共計挑   個單菌落，陽性率    （陽性條帶數/單菌落個數）。

測序

（推薦使用一條載體通用測序引物+目的片段另一端引物送去測序驗證）

載體、片段制備

高保真PCR

2× Hieff Canace® AdvanceFast PCR Master Mix (With Dye)

10164ES03/08

1 mL/5×1 mL

同源重組

1-7片段一步法定向連接，最快5分鐘完成重組反應

Hieff Clone® Universal II One Step Cloning Kit

10923ES20/50

20 T/50 T

轉化

5 min快速完成感受態轉化

F DH5α化學感受態

11803ES80

10×100 μL

菌落PCR

快速PCR升級，可菌P且適用復雜模板擴增

2×Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR Master Mix

10167ES03/08

1 mL/5×1 mL

目的片段保存、測序

TOPO克隆-兼容TA/平末端

Hieff Clone® Universal Zero TOPO TA/Blunt Cloning Kit

10906ES20

20 T