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新手必看!Nanopore 與 Pacbio,三代測序技術(shù)解析入門指南!

來源:翌圣生物科技(上海)股份有限公司   2025年01月21日 08:45  

近幾年,二代建庫測序周期已經(jīng)得到飛速提升,同時第二代短讀長測序技術(shù)在測序市場上仍然占有絕對優(yōu)勢,但第三代測序技術(shù)自2008年以來也發(fā)展的如火如荼,憑借其長讀長優(yōu)勢且測序過程無需進行PCR擴增,實現(xiàn)了對每一條DNA分子的單獨測序,已廣泛應(yīng)用于基因組拼接、病原體研究和突變鑒定等多種方面。


 

 

三代測序之原理篇

 

第三代測序技術(shù)又稱為單分子DNA測序,即通過現(xiàn)代光學(xué)、高分子、納米技術(shù)等手段來區(qū)分堿基信號差異的原理,以達到直接讀取序列信息的目的。目前商業(yè)化主流的三代測序技術(shù)是Pacific Biosciences公司的SMRT技術(shù)和Oxford Nanopore Technologies公司的納米孔單分子技術(shù)。與前兩代技術(shù)相比,他們最大的特點是單分子測序,其中SMRT技術(shù)利用熒光信號進行測序,而納米孔單分子測序技術(shù)利用不同堿基產(chǎn)生的電信號進行測序。

 

 

 

三代測序之應(yīng)用篇

 

目前長讀長測序的三代測序平臺,已廣泛應(yīng)用于復(fù)雜動植物基因組、微生物基因組、全長轉(zhuǎn)錄組、微生物群體研究及人類基因組變異檢測等領(lǐng)域的科研項目中,以解決這些科研領(lǐng)域檢測技術(shù)瓶頸的問題。在臨床疾病檢測方面,三代測序技術(shù)在基因組結(jié)構(gòu)變異、短串聯(lián)重復(fù)/微衛(wèi)星、甲基化檢測等遺傳病及腫瘤基因檢測相關(guān)領(lǐng)域具有獨到的優(yōu)勢,目前基于三代測序技術(shù)的遺傳病基因診斷產(chǎn)品層出不窮。

 

 

三代文庫制備之DNA/RNA QC

 

提取后DNA/RNA的質(zhì)量會影響文庫制備,因為選擇不同的提取方法,DNA/RNA樣品中會有不同的化學(xué)試劑殘留可能抑制酶的活性,同時DNA/RNA的完整性影響下游文庫制備效率,進而影響測序質(zhì)量。

  • 純度:DNA/RNA純度較高,無RNA或DNA、蛋白質(zhì)污染(需專門適配長片段提取試劑盒);

  • 濃度:大于等于30 ng/uL;

  • 完整性:無降解,DNA脈沖場凝膠分析測量的平均片段大小>30kb,RNA RIN≥8;

  • 樣品量:DNA大于等于1 μg(不同數(shù)據(jù)量需求略有不同);

  • 建議使用TE緩沖液長期儲存高分子量(HMW)gDNA。

 

 

三代文庫制備之?dāng)?shù)據(jù)質(zhì)控

 

不同于二代測序的堿基質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)Q20/Q30,三代測序由于其隨機分布的堿基錯誤率,其單堿基的準(zhǔn)確性不能直接用于衡量數(shù)據(jù)質(zhì)量。最直接的方法是看長度。長度短的測序數(shù)據(jù)不一定差(與文庫大小有關(guān)),但差的數(shù)據(jù)長度一定短。在上游測序,最關(guān)鍵的影響因素是文庫的構(gòu)建。高質(zhì)量的文庫產(chǎn)出的數(shù)據(jù)長度長,質(zhì)量好;而低質(zhì)量的文庫產(chǎn)出的數(shù)據(jù)長度短,質(zhì)量差。

  • PacBio 測序數(shù)據(jù)QC:數(shù)據(jù)產(chǎn)出(G)、酶讀長、插入片段長度、subreads N50

  • nanopore測序數(shù)據(jù)QC:數(shù)據(jù)產(chǎn)出(G)、平均讀長、平均質(zhì)量值(Q)、Read length N50、最長reads長度及質(zhì)量值,最重要的兩個指標(biāo)為長度分布與平均Q值。

 

翌圣生物匠心研發(fā)多款適配Nanopore平臺的建庫試劑盒滿足眾多客戶的不同需求,助力科學(xué)研究和臨床檢測更精準(zhǔn)、更快捷!

 

 

翌圣三代建庫產(chǎn)品選擇指南

 

產(chǎn)品類別

產(chǎn)品名稱

貨號

連接法建庫

Hieff® DNA Library Prep Kit for ONT

13301ES

末修加A模塊

Hieff® DNA Endprep&dA-Tail Module for ONT

13302ES

Barcode接頭連接模塊

Hieff® DNA Endprep&dA-Tail Module for ONT

13303ES

馬達蛋白接頭連接模塊

Hieff ® Adapter Ligation Module for ONT

13304ES

片段化/末修/加A模塊

Hieff ® Adapter Ligation Module for ONT

13309ES

長片段高保真擴增酶

Hieff NGS® Multiplex Long PCR Master Mix

17228ES

配套建庫產(chǎn)品

Hieff NGS® DNA Selection Beads 分選磁珠(替代AMPure XPBeads)

12601ES

1×dsDNA HS Assay Kit

12642ES



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